玉米乙酰乳酸合成酶基因单碱基编辑创制氯磺隆除草剂抗性种质
发布时间：2021-03-07 19:15
农田杂草与作物竞争生长空间、光照、水、土壤、养分等资源,形成草害,导致作物减产并造成严重经济损失。随着杀草谱广、活性高、除草效果好且对环境友好的除草剂被不断成功研发应用,除草剂使用面积不断扩大,已成为农田杂草治理主要方式。但是,除草剂导致农作物药害事故频发,成为农业生产亟待解决的重要问题之一。通过常规与生物技术方法培育除草剂抗性作物品种为该问题的解决提供了有效途径。常规除草剂抗性育种受限于难以筛选与发现稀有的突变。转基因生物技术则需要复杂且时间和经济成本高昂的环境与生物安全审批流程以及跨国公司对该领域专利的技术垄断。因此,通过基因编辑技术定点突变玉米等作物的内源基因培育抗性品种,具有重大的产业应用前景与价值。本研究以玉米（Zea mays L.）乙酰乳酸合成酶基因（ZmALS1和ZmALS2）为靶基因,构建了胞嘧啶单碱基编辑工具,通过精确单碱基编辑的方式将玉米ZmALS1和ZmALS2中第165位脯氨酸替换为丝氨酸,在不影响支链氨基酸合成代谢活性的情况下,降低其对氯磺隆除草剂的敏感性,创制氯磺隆除草剂抗性玉米种质。主要结果如下:1、以残基肽XTEN为衔接物将大鼠胞嘧啶脱氨酶（APOBE...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ZmALS1和ZmALS2基因sgRNA设计
图 2.2 ALS-CBE 载体图谱Figure 2.2 ALS-CBE vector map.2.3 载体遗传转化和阳性植株鉴定构建完成的质粒的遗传转化的步骤如下：（1）ALS-CBE 载体转化 BMEHA105 农杆菌感受态细胞以获得重组农杆菌；（2）N6 液体培养基培养重组农杆菌至菌液 OD600nm为 0.8；（3）菌液于 5000 rpm 转速下离心 10 min，收集菌体；（4）侵染缓冲液悬浮菌体，使 OD600nm为 0.5 左右；（5）28℃，150 rpm 条件下震荡培养 30 min 即用于侵染;（6）选取状态良好的愈伤组织在侵染缓冲液中浸泡 1 h；（7）转至上述（5）侵染液中浸泡 15 min，弃菌液并用滤纸吸干多余菌液；（8）将上述（6）中的愈伤组织置于固体共培养基中，28℃暗培养 10 天；（9）转至含有草甘膦的恢复培养基中，相同条件下培养 7 天筛选出阳性愈伤组织；（10）将上述（8）阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基 28℃暗培养 14 天；（11）将上述（9）中胚状体转至分化培养基，培养至幼苗长到一定高度，暴露于空气中，3
20图 3.1 T1 代转基因植株中 ZmALS1 靶位点突变谱Figure 3.1 Mutation profile of ZmALS1 target site in T1 transgenic plants ：WT 野生型。序列图中横线部分为 sgRNA,红色标记字母为 PAM。绿色标记字母表示靶标替换为 T,其他替换用蓝色字母表示。峰中不同碱基用不同颜色的峰表示，虚线框内是碱基替换发生的部位，黄色阴影为 PAM。ote：WT wild type. In the sequence diagram, the cross-hatched portion is sgRNA, the red-marked letter is PAM. The green-marked letterdicates that it is replaced with T, and the other replacements are indicated by blue letters. The different bases in the peak map are represented byaks of different colors. The dotted line is the part where the base substitution occurs, and the yellow shade is PAM..3 突变植株氯磺隆除草剂抗性表型鉴定.3.1 氯磺隆除草剂有效作用浓度梯度筛选玉米出苗后的第三周，使用 5 个梯度浓度氯磺隆喷施处理玉米苗，并设置一个阴性对照。四后观察玉米苗表型：不同浓度处理下玉米苗生长状况不同。如图 3.2 所示，100 mg/L 处理下的株完全枯萎死亡，因此将 100 mg/L 作为氯磺隆的有效作用浓度。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2016年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. 中国生物工程杂志. 2017(04)
[2]ACCase抑制除草剂及杂草对其抗性的发展与治理[J]. 苏少泉. 农药. 2015(06)
[3]浅谈玉米田草害成因及其防治的方法[J]. 王斌. 中国新技术新产品. 2015(09)
[4]水稻田间常见杂草的发生及其防治[J]. 杨丽娟. 吉林农业. 2014(07)
[5]除草剂及抗除草剂作物的应用现状与展望[J]. 陈海伟,张鲁华,陈德富,陈喜文. 生物技术通报. 2012(10)
[6]乙酰乳酸合成酶抑制型除草剂抗性作物的创制与发展[J]. 苏少泉. 世界农药. 2011(03)
[7]原卟啉原氧化酶抑制性除草剂的发展[J]. 苏少泉. 农药研究与应用. 2011(01)
[8]植物转基因技术的诞生和发展[J]. 杨长青,王凌健,毛颖波,陈晓亚. 生命科学. 2011(02)
[9]我国杂草学研究现状及其发展策略[J]. 强胜. 植物保护. 2010(04)
[10]非转基因抗除草剂作物研究现状与展望[J]. 陶波,张洪岩,张庆贺,韩玉军. 植物保护学报. 2010(03)
本文编号：3069658
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
ZmALS1和ZmALS2基因sgRNA设计
图 2.2 ALS-CBE 载体图谱Figure 2.2 ALS-CBE vector map.2.3 载体遗传转化和阳性植株鉴定构建完成的质粒的遗传转化的步骤如下：（1）ALS-CBE 载体转化 BMEHA105 农杆菌感受态细胞以获得重组农杆菌；（2）N6 液体培养基培养重组农杆菌至菌液 OD600nm为 0.8；（3）菌液于 5000 rpm 转速下离心 10 min，收集菌体；（4）侵染缓冲液悬浮菌体，使 OD600nm为 0.5 左右；（5）28℃，150 rpm 条件下震荡培养 30 min 即用于侵染;（6）选取状态良好的愈伤组织在侵染缓冲液中浸泡 1 h；（7）转至上述（5）侵染液中浸泡 15 min，弃菌液并用滤纸吸干多余菌液；（8）将上述（6）中的愈伤组织置于固体共培养基中，28℃暗培养 10 天；（9）转至含有草甘膦的恢复培养基中，相同条件下培养 7 天筛选出阳性愈伤组织；（10）将上述（8）阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基 28℃暗培养 14 天；（11）将上述（9）中胚状体转至分化培养基，培养至幼苗长到一定高度，暴露于空气中，3
20图 3.1 T1 代转基因植株中 ZmALS1 靶位点突变谱Figure 3.1 Mutation profile of ZmALS1 target site in T1 transgenic plants ：WT 野生型。序列图中横线部分为 sgRNA,红色标记字母为 PAM。绿色标记字母表示靶标替换为 T,其他替换用蓝色字母表示。峰中不同碱基用不同颜色的峰表示，虚线框内是碱基替换发生的部位，黄色阴影为 PAM。ote：WT wild type. In the sequence diagram, the cross-hatched portion is sgRNA, the red-marked letter is PAM. The green-marked letterdicates that it is replaced with T, and the other replacements are indicated by blue letters. The different bases in the peak map are represented byaks of different colors. The dotted line is the part where the base substitution occurs, and the yellow shade is PAM..3 突变植株氯磺隆除草剂抗性表型鉴定.3.1 氯磺隆除草剂有效作用浓度梯度筛选玉米出苗后的第三周，使用 5 个梯度浓度氯磺隆喷施处理玉米苗，并设置一个阴性对照。四后观察玉米苗表型：不同浓度处理下玉米苗生长状况不同。如图 3.2 所示，100 mg/L 处理下的株完全枯萎死亡，因此将 100 mg/L 作为氯磺隆的有效作用浓度。
【参考文献】：
期刊论文
[1]2016年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J]. 中国生物工程杂志. 2017(04)
[2]ACCase抑制除草剂及杂草对其抗性的发展与治理[J]. 苏少泉. 农药. 2015(06)
[3]浅谈玉米田草害成因及其防治的方法[J]. 王斌. 中国新技术新产品. 2015(09)
[4]水稻田间常见杂草的发生及其防治[J]. 杨丽娟. 吉林农业. 2014(07)
[5]除草剂及抗除草剂作物的应用现状与展望[J]. 陈海伟,张鲁华,陈德富,陈喜文. 生物技术通报. 2012(10)
[6]乙酰乳酸合成酶抑制型除草剂抗性作物的创制与发展[J]. 苏少泉. 世界农药. 2011(03)
[7]原卟啉原氧化酶抑制性除草剂的发展[J]. 苏少泉. 农药研究与应用. 2011(01)
[8]植物转基因技术的诞生和发展[J]. 杨长青,王凌健,毛颖波,陈晓亚. 生命科学. 2011(02)
[9]我国杂草学研究现状及其发展策略[J]. 强胜. 植物保护. 2010(04)
[10]非转基因抗除草剂作物研究现状与展望[J]. 陶波,张洪岩,张庆贺,韩玉军. 植物保护学报. 2010(03)
本文编号：3069658
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3069658.html
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