不同信号刺激对禽致病性大肠杆菌phoP基因转录和表达的影响

发布时间：2021-03-17 23:21

　　禽大肠杆菌病由于其发病率高,病原菌血清型多样对各国禽类养殖业产生严重危害。APEC中的PhoP-PhoQ二元调控系统主要参与调控细菌毒力基因的表达、细菌对Mg2+限制性生长环境的适应过程、上皮细胞侵袭和抗菌肽抗感染等过程,在禽致病性大肠杆菌致病的过程中发挥着重要的调控作用。有研究发现酸性pH、低Mg2+和抗菌肽能够促进PhoP的磷酸化,激活PhoP蛋白调控的下游靶基因使细菌适应环境的改变。因此本研究以AE17、△phoP、△phoQ和△phoPQ缺失株为研究对象,以Mg2+浓度,酸性pH和禽β防御素（AvBD9）为培养条件检测其细菌的体外生长情况。通过制备PhoP兔源多克隆抗体,利用RT-qPCR和Western blot方法检测不同pH、Mg2+浓度和AvBD9培养环境中phoP基因转录和表达的变化,为进一步研究PhoP在APEC中的调控作用提供理论依据。主要研究内容如下:1.PhoP蛋白表达条件的优化及PhoP多克隆抗体的制备与检测本试验通过优化诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时间和细菌浓度等条件,筛选出目的蛋白表达量最高的优化条件。结果显示菌液培养至OD600nm为1.0时加入终... 

【文章来源】：安徽农业大学安徽省

【文章页数】：71 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２－９?ＢＣＡ法测定蛋白含量??Ｆｉｇ．９?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ＢＣＡ?ｍｅｔｈｏｄｓ??

蛋白样品???浓度（ｆｉｇ／ｍｌ）?ＯＤ５６２?浓度（ｍｇ／ｍｌ）?ＯＤ５６２??０?０．１１１??２５?０．１１９??７５?０．１３１??１２５?０．１４０??３．６２１?１．０４１??２５０?０．１７４??５００?０．２４３??７５０?０．３０５??１０００?０３６６??２．３禽致病性大肠杆菌ＰｈｏＰ蛋白多克隆抗体的检测??２．３．１双向琼脂扩散法检测兔抗ＰｌｉｏＰ血清效价??２．３．１．１最佳蛋白浓度条件的摸索??双向琼脂扩散结果如图２－丨０，可见在抗原浓度为０．２?ｍｇ／ｍ丨时，仍呈现明显沉线，??因此，最佳抗原浓度为０．２?ｍｇ／ｍｌ。??２?？．秦?１??图２－?１０最佳抗原浓度条件的测定??Ｆｉｇ．?２－１０?Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｏｐｔｉｍａｌ?ａｎｔｉｇｅｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??卜６：?ｌ?ｍｇ／ｍｌ、０．８?ｍｇ／ｍｌ、０．６?ｍｇ／ｍｌ、０．４?ｍｇ／ｍｌ、０．３?ｍｇ／ｍｌ、０．２?ｍｇ／ｍｌ；?７：免疫血清??ｌ－６：?ｌ?ｍｇ／ｍｌ，?０．８?ｍｇ／ｍｌ，?０．６?ｍｇ／ｍｌ，?０．４?ｍｇ／ｍｌ，?０．３?ｍｇ／ｍｌ，?０．２?ｍｇ／ｍｌ；?７：?ｉｍｍｕｎｅ?ｓｅｒｕｍ??２．３．１．２血清效价的测定??双向琼脂扩散结果如图２－丨丨，可见在抗体稀释度为丨：１６时，仍呈现明显沉线，??兔抗ＰｈｏＰ多克隆抗体效价为１：１６。??２５??

＾＾１??Ｍｇ？８Ｗ??图２－?１丨双向琼脂扩散实验检测ＰｈｏＰ多克隆血清效价??Ｆｉｇ．２－１１?Ｄｏｕｂｌｅ?ａｇａｒ?ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ?ｔｅｓｔ?ｏｆ?ＰｈｏＰ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｉｎ?ｒａｂｂｉｔｓ??１：免疫血清原液；２－６：?１：?２、１：?４、１：?８、１：?１６、１：?３２稀释的免疫血清；７：?ＰｈｏＰ蛋白??１：?ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ；?２－６：?ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ?ｄｉｌｕｔｅｄ?ｂｙ?１：２，?１：４，?１：８，?１：１６，?１：３２；?７：?ＰｈｏＰ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２＿３＿２?ＥＬＩＳＡ法检测兔抗ＰｈｏＰ血清效价??用ＥＬＩＳＡ法检测加强免疫后的兔血清抗体效价，免疫后血清效价吸光度与免疫??前血清效价吸光度比值大于２，则判断为阳性。兔子经过４次免疫后，获得ＰｈｏＰ蛋??白抗血清，经ＥＬＩＳＡ法检测，其效价可达到１：２０９７１５２００，如图２－１２所示。??５０．０??４５．０?？—???４０．０??§?３５．０?＼??ｇ?３。．。?＼??＾?２５．０?＇??＾?２０－°?＼??窆?１５．０?????１〇＇°?？??Ｊ?———??４００００?１６００００?６４００００?２５６００００?１０２４００００?４０９６００００?１６３８４００００?６５５３６００００??抗体稀释度??图２－?１２兔抗ＰｈｏＰ蛋白多克隆抗体效价曲线??Ｆｉｇ．２－１２?Ｔｈｅ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｒａｂｂｉｔ?ａｎｔｉ－ＰｈｏＰ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｔｉｔｅｒ??２．３．３兔抗ＰｈｏＰ血清的


本文编号：3087896