本氏烟钙调素类似蛋白Nbrgs-CaM抑制转录后基因沉默的机理研究

发布时间：2017-04-15 17:19

  本文关键词：本氏烟钙调素类似蛋白Nbrgs-CaM抑制转录后基因沉默的机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：转录后基因沉默(Post transcriptional gene silencing, PTGS)是植物抵抗病毒侵染的一种机制,病毒为了成功侵染寄主植物会编码RNA沉默抑制子。中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)伴随的卫星分子Beta (Tomato yellow leaf curl China Betasatellite, TYLCCNB)编码的唯一蛋白pCl是一个重要的致病因子和RNA沉默抑制子。βC1可以上调本氏烟中的钙调素类似蛋白基因Nbrgs-CaM来抑制RNA沉默途径中的重要基因NbRDR6的表达,从而抑制RNA沉默。Nbrgs-CaM被证实是一个植物内源的RNA沉默抑制子,并在βCl抑制次级小型干扰RNAs (Small interfering RNAs, siRNAs)的产生及诱导双生病毒的致病性中起了重要作用。植物病毒利用Nbrgs-CaM来反击寄主的防御反应,但是Nbrgs-CaM抑制RNA沉默的具体作用尚不清楚。本文围绕着Nbrgs-CaM与本氏烟沉默抑制子(Suppressor of Gene Silencing 3, NbSGS3)的互作开展深入的研究。NbSGS3在细胞内呈颗粒状分布,这种颗粒状结构被称为SGS3/RDR6小体(SGS3/RDR6 bodies)。对NbSGS3序列进行分析,发现它具有三个典型的结构域。为了明确它的哪一个结构域对于这种颗粒状的定位是必需的,我们分别构建了NbSGS3的各个结构域缺失突变体的亚细胞定位表达载体(pCHF3-NbSGS3-dZF-GFP, pCHF3-NbSGS3-dXS-GFP, pCHF3-NbSGS3-d2CC-GFP)。通过浸润H2B-RFP本氏烟,观察它们的亚细胞定位模式,我们发现NbSGS3的ZF和2CC结构域对于它的亚细胞定位很重要。为了探究NbSGS3的关键定位结构域是否也是它与Nbrgs-CaM的互作结构域,我们构建了NbSGS3的各个结构域缺失突变体的BiFC表达载体(2YN/2YC-NbSGS3-dZF, 2YN/2YC-NbSGS3-dXS,2YN/2YC-NbSGS3-d2CC)。通过在H2B-RFP本氏烟上共表达这些突变体蛋白,分析它们与Nbrgs-CaM蛋白在细胞内的互作情况,结果显示NbSGS3的ZF和2CC结构域对于它与Nbrgs-CaM的互作也是必需的。对Nbrgs-CaM的序列进行分析,发现它具有四个功能结构域。为了探究Nbrgs-CaM的哪个结构域决定了它与NbSGS3的互作,我们构建了Nbrgs-CaM的各个结构域缺失突变体的BiFC表达载体(2YN/2YC-NbCaM-dX,2YN/2YC-NbCaM-dEFI,2YN/2YC-NbCaM-dEFII,2YN/2YC-NbCaM-dEFIV)。在H2B-RFP本氏烟上研究Nbrgs-CaM不同结构域的缺失突变体与NbSGS3蛋白的互作情况,结果显示Nbrgs-CaM的EFI和EFII两个结构域对于它与NbSGS3的互作是必需的。为了明确Nbrgs-CaM与NbSGS3的互作结构域EFI和EFII对于Nbrgs-CaM的PTGS抑制子活性是否同样重要,我们将Nbrgs-CaM及其各个结构域缺失突变体构建到pCambia2300-Flag的重组表达载体上(pCambia2300-NbCaM-dX-Flag, pCambia2300-NbCaM-dEFI-Flag, pCambia2300-NbCaM-dEFII-Flag,pCambia2300-NbCaM-dEFIV-Flag)。分别在野生型本氏烟和16c本氏烟上进行RNA沉默抑制子鉴定实验,结果均显示Nbrgs-CaM与NbSGS3互作所必需的EFI和EFII两个结构域对于Nbrgs-CaM的沉默抑制子功能也是必需的。我们还发现Nbrgs-CaM的过量表达能够降低NbSGS3蛋白的积累量。这些结果说明Nbrgs-CaM可以与NbSGS3互作并降解NbSGS3蛋白的表达从而抑制RNA沉默。
【关键词】：中国番茄黄化曲叶病毒 βC1蛋白 钙调素类似蛋白Nbrgs-CaM 基因沉默抑制子3 NbSGS3 转录后基因沉默
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.41
【目录】：

• 致谢6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-16
• 1 绪论16-30
• 1.1 双生病毒的发生情况与危害程度16
• 1.2 双生病毒的分类和基因组结构16-20
• 1.2.1 菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus)18-19
• 1.2.2 玉米线条病毒属(Mastrevirus)19
• 1.2.3 甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)19-20
• 1.2.4 番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)20
• 1.2.5 伊朗甜菜曲顶病毒属(Becurtovirus)20
• 1.2.6 芜菁曲顶病毒属(Turncurtovirus)20
• 1.2.7 弯叶画眉草条纹病毒属(Eragrovirus)20
• 1.3 菜豆金色花叶病毒属病毒betasatellite的研究进展20-21
• 1.4 双生病毒与RNA沉默21-28
• 1.4.1 RNA沉默机制21-22
• 1.4.2 RNA沉默途径中的抗病毒侵染的核心蛋白22-23
• 1.4.3 双生病毒诱发的RNA沉默23-24
• 1.4.4 双生病毒编码的RNA沉默抑制子24-28
• 1.5 基因沉默抑制子SGS3的研究进展28
• 1.6 钙调素类似蛋白Rgs-CaM的研究进展28-29
• 1.7 本项目的研究目的和研究意义29-30
• 2 实验方法30-49
• 2.1 常规DNA克隆技术30-37
• 2.1.1 PCR技术30-33
• 2.1.2 PCR产物的回收33
• 2.1.3 加A反应33-34
• 2.1.4 连接34
• 2.1.5 感受态细胞的制备34-35
• 2.1.6 转化35
• 2.1.7 菌落PCR筛选35-36
• 2.1.8 重组质粒的提取36
• 2.1.9 重组质粒的酶切验证36-37
• 2.1.10 重组克隆的测序鉴定37
• 2.2 重组质粒导入根癌农杆菌及接种37-38
• 2.2.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备37
• 2.2.2 重组质粒电击转化根癌农杆菌37-38
• 2.2.3 农杆菌的浸润接种38
• 2.3 植物总DNA提取以及Southern blot分析38-43
• 2.3.1 CTAB法大量抽提植物DNA的方法38-40
• 2.3.2 CTAB法小量抽提植物DNA的方法40
• 2.3.3 Southern印迹分析40-43
• 2.4 植物总RNA小量提取、RT-PCR、RT-qPCR、Northern杂交43-46
• 2.4.1 植物总RNA的小量提取43-44
• 2.4.2 反转录RT-PCR及RT-qPCR44-45
• 2.4.3 Northern印迹杂交45-46
• 2.5 植物总蛋白的提取、蛋白的SDS-PAGE及Western blot杂交46-49
• 2.5.1 植物总蛋白的提取46
• 2.5.2 蛋白的SDS-PAGE46-47
• 2.5.3 Western blot分析技术47-49
• 3 Nbrgs-CaM与NbSGS3互作结构域及Nbrgs-CaM抑制子结构域鉴定49-68
• 3.1 材料与方法49-55
• 3.1.1 实验材料49
• 3.1.2 载体的构建49-51
• 3.1.3 农杆菌介导的浸润与接种51
• 3.1.4 GFP荧光记录及样品采集51-52
• 3.1.5 Western blot分析GFP蛋白的表达量52
• 3.1.6 Northern blot分析52-55
• 3.2 结果与分析55-66
• 3.2.1 ZF和2CC结构域对NbSGS3亚细胞定位很重要55-57
• 3.2.2 ZF和2CC结构域对于NbSGS3与Nbrgs-CaM的互作很重要57-59
• 3.2.3 EFⅠ和EFⅡ是Nbrgs-CaM与NbSGS3的互作结构域59-61
• 3.2.4 在野生型本氏烟中鉴定Nbrgs-CaM缺失突变体的抑制子活性61-63
• 3.2.5 在16C本氏烟中鉴定Nbrgs-CaM缺失突变体的抑制子活性63-65
• 3.2.6 Nbrgs-CaM蛋白介导NbSGS3蛋白的降解65-66
• 3.3 讨论66-68
• 4 全文小结68-69
• 附文 TYLCCNB编码的pC1蛋白与NbPsbP的互作机理研究69-90
• 1 绪论69-71
• 2 材料与方法71-75
• 2.1 实验材料71
• 2.2 NbPsbP沉默载体的构建71-72
• 2.3 常温包埋样品制备以及电镜观察细胞结构72
• 2.4 双分子荧光互补实验(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)72-73
• 2.4.1 重组质粒电击转化农杆菌72
• 2.4.2 农杆菌接种72-73
• 2.4.3 激光共聚焦显微镜观察互作结果73
• 2.5 酵母双杂交实验73-74
• 2.5.1 酵母双杂交验证两种已知蛋白的互作73-74
• 2.5.2 酵母蛋白的提取74
• 2.6 NbPsbP总蛋白的提取及Western blot74
• 2.7 NbPsbP总RNA提取、RT-PCR、RT-qPCR及Northern blot74-75
• 3 结果与分析75-90
• 3.1 TYLCCNB编码的βC1蛋白可以引起本氏烟叶绿体变形75-77
• 3.2 TYLCCNB编码的βC1蛋白与NbPsbP蛋白互作77-81
• 3.2.1 BiFC验证βCl蛋白与NbPsbP蛋白的互作77-79
• 3.2.2 酵母双杂交验证pC1蛋白与NbPsbP蛋白的互作79-81
• 3.3 NbPsbP定位于叶绿体81-83
• 3.4 双生病毒10Aβ的侵染显著上调NbPsbP mRNA的表达量83-84
• 3.5 βC1转基因本氏烟中NbPsbP mRNA表达量上调84-85
• 3.6 NbPsbP基因对10Aβ病毒致病性的影响85-88
• 3.6.1 NbPsbP基因沉默表型和沉默水平85-86
• 3.6.2 沉默NbPsbP基因会减轻10Aβ症状并减少病毒的积累量86-88
• 3.7 讨论88-90
• 参考文献90-97
• 附录A：本论文所用缩写词及中英文对照97-99
• 附录B：本论文所用病毒缩写及中英文对照99-100
• 附录C：常用缓冲液及培养基配方100-105

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本文编号：308885