MAZ基因启动子区顺式作用元件的EMSA分析

发布时间：2017-04-15 19:22

  本文关键词：MAZ基因启动子区顺式作用元件的EMSA分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:MAZ参与细胞生理、病理状态下多种基因的转录调控,被调控的基因如基质金属蛋白酶、血清淀粉样蛋白A等与类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心脏疾病、癌症等疾病的发生密切相关。目前研究报道多集中于MAZ介导下游基因的表达调控,而有关MAZ基因的转录调控的研究较少见。该基因的转录受到其启动子区的调控,多种转录因子参与其中。因此,本课题旨在通过对MAZ基因启动子区DNA序列进行转录因子结合位点分析,以发现潜在的转录因子顺式反应元件,并通过突变、竞争及EMSA技术研究这些顺式元件,为揭示MAZ基因转录调控机制奠定基础。方法:1.抽提细胞核蛋白:培养THP-1细胞,收集细胞,使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒提取核蛋白,并通过BCA法进行蛋白定量。2.设计探针及生物素标记:通过PROMO软件分析MAZ基因转录起始点上游948 bp DNA序列潜在的转录因子结合位点,设计覆盖该序列的探针,并进行生物素标记。3.EMSA试验:标记探针与核蛋白进行结合反应,电泳分析,转膜及化学发光显色。4.设计突变探针并进行EMSA分析。5.使用明确的转录因子结合元件进行竞争性EMSA分析。结果:1.本试验研究的MAZ基因启动子区DNA序列可能结合转录因子有40种之多,设计的32条探针仅有11条出现明显的DNA与蛋白结合条带。2.突变探针的EMSA试验及竞争性EMSA分析结果显示,MAZ基因启动子区距转录起始点-525~-504 nt的核酸序列可与转录因子Elk-1在体外相结合,其顺式作用元件为CTTCCCCCA。结论:本课题通过PROMO软件分析、EMSA试验及竞争性EMSA试验,对人类MAZ基因SAF-1转录启始点上游(-948~-1)的启动区潜在的转录因子结合位置进行了筛选。初步筛选检出一个新的转录因子结合位置,但尚需超迁移试验进一步鉴定;对于进一步研究MAZ基因的转录机制调控提供可靠的实验依据及EMSA技术支持。
【关键词】：MAZ基因 PROMO EMSA 顺式作用元件
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：D919
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 常用缩写词中英文对照表10-11
• 缩写名词附表11-12
• 前言12-14
• 1 材料14-17
• 1.1 主要仪器14
• 1.2 主要试剂及耗材14-15
• 1.3 主要配制试剂15-17
• 2 方法17-31
• 2.1 方法设计思路17
• 2.2 实验流程17-18
• 2.3 THP-1 细胞的培养及核蛋白的提取18-20
• 2.3.1 THP-1 细胞的复苏18-19
• 2.3.2 THP-1 细胞的换液与传代培养19
• 2.3.3 THP-1 细胞的冻存19
• 2.3.4 THP-1 细胞核蛋白的提取19-20
• 2.3.5 BCA法测定核蛋白浓度20
• 2.4 MAZ启动子区转录因子结合位点的预测及screen探针设计20-23
• 2.5 Screen probe的EMSA试验23-26
• 2.5.1 生物素标记探针23
• 2.5.2 4.9%聚丙烯酰胺凝胶的制备23-24
• 2.5.3 EMSA结合反应——探针与核蛋白的结合24
• 2.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析24-25
• 2.5.5 转膜及紫外交联25
• 2.5.6 化学发光法检测生物素标记探针25-26
• 2.6 突变探针的设计及EMSA实验26-29
• 2.7 竞争性EMSA试验29-31
• 3 结果31-37
• 3.1 MAZ启动子区转录因子结合位点的软件预测结果31-32
• 3.2 Screen probe的EMSA鉴定结果32-33
• 3.3 Mutant screen probe的EMSA鉴定结果33-34
• 3.4 Second mutant screen probe 15的EMSA鉴定结果34-35
• 3.5 Screen probe 15的竞争性EMSA结果35-37
• 4 讨论37-44
• 4.1 MAZ启动子区DNA序列的EMSA鉴定结果37-40
• 4.2 EMSA试验成功的关键因素40-42
• 4.3 EMSA技术的局限性42
• 4.4 PROMO对转录因子结合位点的预测42-44
• 5 结论44-45
• 参考文献45-50
• 综述50-59
• 参考文献54-59
• 致谢59-61
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果61-62
• 个人简历62

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本文编号：309092