拟南芥BES1转录因子家族多基因缺失突变体的构建及表型观察统计

发布时间：2017-04-16 06:15

  本文关键词：拟南芥BES1转录因子家族多基因缺失突变体的构建及表型观察统计，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：BES1是拟南芥油菜素类固醇(Brassinosteroids,简称BR)信号通路下游的转录因子,该转录因子家族包括BES1、BZR1、BEH1、BEH2、BEH3、BEH4六个同源性很高的成员。到目前为止,已经有很多研究者证明,此家族成员中的BZR1、BES1参与BR信号的响应、细胞的伸长与分裂、叶与根的生长发育、维管组织的发育、植物的开花、雄蕊的育性、抗逆性、衰老等多个方面的调控。与此同时,研究者也证明了BES1和BZR1与其他转录因子比如BIM1、PIF4一起结合到共同靶基因的启动子区域来共同调节靶基因的表达。然而,之前的大多数研究都是从BZR1或BES1单个转录因子着手,通过研究它们的功能获得型突变体植株(bes1-D,bzr1-1D)或RNAi遗传材料来推测它们的重要性。但是,几乎没有研究者用此家族基因的完全缺失突变体来进行探究此家族基因的重要性。本研究将主要通过遗传学方式来探讨BZR1转录因子家族对拟南芥生长发育的重要性。对从ABRC种子库订购的T-DNA种子,我们首先通过RT-PCR的方式确定相应基因完全敲除,再进行遗传杂交,预计分别获取纯合二突变体、三突变体、四突变体、五突变体、六突变体的植株,并进行表型观察与统计、相关生理实验及统计。到目前为止,我们已经获得二突变体、三突变体、四突变体、五突变体的纯合突变体植株。我们对所有突变体进行表型观察,发现三周龄的苗莲座叶长度、莲座宽度,抽薹时间,六周龄的苗分枝数与野生型相比,差异不明显;我们还对各突变体进行激素处理:与野生型相比,100 nM BL对各突变体的处理前后,各突变体的根长的变化不明显;500 nM BRZ处理前后,各突变体的下胚轴变化与野生型相比也不明显。为进一步支持我们的结论,我们还构建了BZR1和BES1的SRDX转基因植株,进行与上述相同的表型观察与统计、生理实验分析得出了相似的结果。此外,我们用100 nM BL对各突变体进行处理,发现该转录因子家族的靶基因CPD和DWF4的表达量变化与野生型很类似。我们还通过Promoter::GUS对六个基因的表达模式进行分析,确定各个基因的表达部位,但我们并未从各基因缺失突变体中,发现基因缺失对拟南芥生长发育的影响。综上,BES1转录因子家族五个基因(除BEH2)的缺失可能并未对拟南芥正常生长发育造成明显的影响。
【关键词】：BZR1 BES1 转录因子 突变体 处理
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-10
• 第一章 前言10-17
• 1.1 油菜素内酯信号通路10-15
• 1.1.1 油菜素内酯的发现10
• 1.1.2 油菜素内酯信号通路的完善10-12
• 1.1.3 BES1/BZR1转录因子的发现及其功能研究12-15
• 1.1.4 BES1转录因子家族15
• 1.2 本研究的思路15-17
• 第二章 材料与方法17-33
• 2.1 基因型鉴定17-19
• 2.1.1 实验材料17
• 2.1.2 拟南芥基因组DNA的快提溶液的配制方法17
• 2.1.3 拟南芥基因组DNA的快提方法17
• 2.1.4 拟南芥基因型鉴定17-19
• 2.2 拟南芥遗传杂交19-20
• 2.2.1 材料19
• 2.2.2 杂交步骤19-20
• 2.3 DNA的琼脂糖凝胶电泳20-21
• 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳的原理20
• 2.3.2 所需试剂与仪器20
• 2.3.3 DNA凝胶电泳的步骤20-21
• 2.4 植物总RNA之快速提取法21-22
• 2.4.1 所需试剂及材料21
• 2.4.2 植物总RNA的提取步骤21-22
• 2.5 反转录及RT-PCR22-23
• 2.5.1 所需仪器及试剂22
• 2.5.2 反转录的步骤22
• 2.5.3 RT-PCR22-23
• 2.6 基因克隆技术23-26
• 2.6.1 实验所需试剂、仪器23
• 2.6.2 克隆基因的步骤23-25
• 2.6.3 BP反应25
• 2.6.4 BP反应产物转化DH5α 感受态细胞25
• 2.6.5 菌落PCR与结果判断25-26
• 2.6.6 对入门载体做LR反应26
• 2.6.7 表达载体的获得26
• 2.7 转基因植物材料的构建26-27
• 2.7.1 农杆菌的热激转化26-27
• 2.7.2 农杆菌浸花感染27
• 2.8 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备27-29
• 2.8.1 所需试剂及仪器27-28
• 2.8.2 DH5α 感受态细胞的制备的方法步骤28-29
• 2.9 GUS染色技术29-30
• 2.9.1 试剂、材料与仪器29-30
• 2.9.2 GUS染色的具体步骤30
• 2.10 拟南芥种子的消毒处理30
• 2.10.1 试剂及材料30
• 2.10.2 种子消毒的步骤30
• 2.11 实验室常用抗生素的配制30-31
• 2.11.1 试剂与材料30-31
• 2.11.2 常见抗生素的工作浓度及储存浓度31
• 2.11.3 配制方法31
• 2.12 实验室常用培养基的配制31-33
• 2.12.1 LB培养基的配制31-32
• 2.12.2 MS培养基的配制32-33
• 第三章 实验结果33-74
• 3.1 对所有T-DNA突变体基因型鉴定33-34
• 3.2 RT-PCR检测各T-DNA插入突变34-35
• 3.3 BES1转录因子家族六个基因表达模式分析35-42
• 3.4 单基因缺失突变体的表现型42-50
• 3.4.1 单基因缺失突变体的莲座表型观察与统计42-44
• 3.4.2 单基因缺失突变体的光下、暗下生长表型观察与统计44-46
• 3.4.3 单基因缺失突变体激素处理的表型观察与数据统计分析46-48
• 3.4.4 单基因缺失突变体抽薹时间、分枝数的统计分析48-50
• 3.5 现有单基因缺失突变体的遗传杂交结果50-51
• 3.6 现有双基因、多基因缺失突变体表型观察与数据分析统计51-67
• 3.6.1 双基因、多基因缺失突变体的莲座表型观察与统计51-54
• 3.6.2 双基因、多基因缺失突变体的光下、暗下生长表型观察与统计54-59
• 3.6.3 双基因、多基因缺失突变体激素处理的数据统计分析59-62
• 3.6.4 双基因、多基因缺失突变体抽薹时间、分枝数的统计分析62-65
• 3.6.5 部分多基因缺失突变体 100 nM BL处理前后BR合成基因的表达量变化65-67
• 3.7 BZR1-SRDX和BES1-SRDX转基因植株构建、表型观察与统计67-74
• 3.7.1 转基因材料的莲座叶表型观察与数据统计67-69
• 3.7.2 转基因材料的光下、暗下生长表型观察与统计69-71
• 3.7.3 激素处理前后的转基因植株的表型观察与数据统计分析71-72
• 3.7.4 转基因植株的抽薹时间、分枝数的统计分析72-74
• 第四章 讨论74-78
• 附录78-81
• 参考文献81-85
• 致谢85

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  本文关键词：拟南芥BES1转录因子家族多基因缺失突变体的构建及表型观察统计，由笔耕文化传播整理发布。

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