利用CRISPR/Cas9技术构建纯合bmp9基因敲除C57BL/6小鼠
发布时间：2021-03-20 23:15
肝纤维化是一种由慢性肝脏损伤引起的病理变化,常见于酒精肝、脂肪肝及病毒性肝炎中。目前关于肝纤维化影响因子的报道有很多,但这些因子大多都与骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）的调控密切相关,BMP9或直接或以调控通路蛋白的形式间接参与了其中很多分子的转录、翻译和激活调控。BMP9是一种主要由肝脏表达分泌的生长分化因子,之前的研究大多集中于其参与干细胞分化及成骨形成过程,它在肝脏疾病尤其是慢性肝纤维化病程中的作用机制还鲜有报道。第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种方便快捷的基因操作工具,它的出现极大地方便了生物科学研究。此技术只需针对靶序列进行sgRNA设计,科研人员就可以对几乎所有感兴趣的基因进行编辑和修饰,从而实现定点敲除或敲入。本研究通过胚胎显微注射bmp9 sgRNA和Cas9 mRNA的方法,成功建立纯合的bmp9基因敲除的C57BL/6小鼠,同时通过优化条件建立起成熟的基因敲除动物操作体系,为后期阐明BMP9参与调节肝纤维化的分子机制和具体的通路研究奠定基础,也为其它基因修饰动物模型的制作提供经验指导。研究工作取得如下...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
bmp9sgRNA设计图例Fig3-1ThesgRNAchosentoknockoutbmp9
4 5 3 4 5 3 4 5 毒质粒连接产物sgRNA361 和 sgRNA367 编码序列分别克隆入 len别对三个重组慢病毒质粒进行双酶切，1%琼脂糖凝之后，核酸电泳结果显示，lenti-271、lenti-361、le00bp 的片段（图 3-2），大小与实验预期相符，说明
分别检测三种病毒的 CT 制，带入标曲中计算其滴度。（见表 3-14）滴度检测结果显示，包装的三种敲除慢病毒载体可以用于细胞的敲除试验。表 3-14 慢病毒滴度测定结果Table 3-14 Result of Lentivirus titer慢病毒 滴度（copies/mL）lenti-271 3.14×105lenti-361 3.36×104lenti-367 2.79×1043.3.4慢病毒感染 胞形态及活力变化用对照空慢病毒载体和设计包装的三种敲除慢病毒（lenti-271，lenti-361 和 lenti-367）分别感染 L929 细胞，嘌呤霉素加压筛选得到阳性克隆，用 CCK-8 法绘制这些阳性克隆细胞 5 天内的生长曲线，结果如图 3-3 所示，结果表明，敲除组与野生型细胞组在细胞生长活性上没有明显变化，形态也没有明显差异，观察结果如图 3-4 所示。说明 bmp9基因敲除后不会对细胞的活性产生显著的影响。
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用CRISPR/Cas9编辑广东小耳花猪MSTN基因[J]. 王敏,黄翔,石翾,刘小凤,曾检华,刘小红,陈瑶生,何祖勇. 广东农业科学. 2017(02)
[2]激素剂量及周龄对小鼠超数排卵的影响[J]. 吴银玲,石梦雅,董鑫,周志勇,葛少钦. 医学研究与教育. 2016(02)
[3]周龄和激素水平对长爪沙鼠超数排卵效果的影响[J]. 路静,朱祥宇,王超,王迎,陈振文,杜小燕. 中国比较医学杂志. 2012(08)
[4]不同激素剂量和组合对不同品系小鼠超数排卵的影响[J]. 邱泽文,姜午旗,高丽波,罗光彬,陈军,詹红微,高文婷,王靖宇. 中国组织工程研究与临床康复. 2011(53)
[5]骨形态发生蛋白9诱导成骨相关TGFβⅡ型受体的鉴定分析[J]. 赵迎泽,张燕,罗进勇. 生物化学与生物物理进展. 2010(10)
[6]不同激素剂量对幼鼠超数排卵及超排卵质量的影响[J]. 李子义,谭景和,孙兴参,刘忠华,周琪,贺桂馨. 黑龙江畜牧兽医. 1999(03)
本文编号：3091846
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
bmp9sgRNA设计图例Fig3-1ThesgRNAchosentoknockoutbmp9
4 5 3 4 5 3 4 5 毒质粒连接产物sgRNA361 和 sgRNA367 编码序列分别克隆入 len别对三个重组慢病毒质粒进行双酶切，1%琼脂糖凝之后，核酸电泳结果显示，lenti-271、lenti-361、le00bp 的片段（图 3-2），大小与实验预期相符，说明
分别检测三种病毒的 CT 制，带入标曲中计算其滴度。（见表 3-14）滴度检测结果显示，包装的三种敲除慢病毒载体可以用于细胞的敲除试验。表 3-14 慢病毒滴度测定结果Table 3-14 Result of Lentivirus titer慢病毒 滴度（copies/mL）lenti-271 3.14×105lenti-361 3.36×104lenti-367 2.79×1043.3.4慢病毒感染 胞形态及活力变化用对照空慢病毒载体和设计包装的三种敲除慢病毒（lenti-271，lenti-361 和 lenti-367）分别感染 L929 细胞，嘌呤霉素加压筛选得到阳性克隆，用 CCK-8 法绘制这些阳性克隆细胞 5 天内的生长曲线，结果如图 3-3 所示，结果表明，敲除组与野生型细胞组在细胞生长活性上没有明显变化，形态也没有明显差异，观察结果如图 3-4 所示。说明 bmp9基因敲除后不会对细胞的活性产生显著的影响。
【参考文献】：
期刊论文
[1]应用CRISPR/Cas9编辑广东小耳花猪MSTN基因[J]. 王敏,黄翔,石翾,刘小凤,曾检华,刘小红,陈瑶生,何祖勇. 广东农业科学. 2017(02)
[2]激素剂量及周龄对小鼠超数排卵的影响[J]. 吴银玲,石梦雅,董鑫,周志勇,葛少钦. 医学研究与教育. 2016(02)
[3]周龄和激素水平对长爪沙鼠超数排卵效果的影响[J]. 路静,朱祥宇,王超,王迎,陈振文,杜小燕. 中国比较医学杂志. 2012(08)
[4]不同激素剂量和组合对不同品系小鼠超数排卵的影响[J]. 邱泽文,姜午旗,高丽波,罗光彬,陈军,詹红微,高文婷,王靖宇. 中国组织工程研究与临床康复. 2011(53)
[5]骨形态发生蛋白9诱导成骨相关TGFβⅡ型受体的鉴定分析[J]. 赵迎泽,张燕,罗进勇. 生物化学与生物物理进展. 2010(10)
[6]不同激素剂量对幼鼠超数排卵及超排卵质量的影响[J]. 李子义,谭景和,孙兴参,刘忠华,周琪,贺桂馨. 黑龙江畜牧兽医. 1999(03)
本文编号：3091846
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