大菱鲆源温和气单胞菌群体感应luxI/luxR基因表达及其抑制剂的研究
发布时间：2021-03-21 01:26
大菱鲆是我国重要的水产养殖经济鱼类,由于蛋白含量高、脂肪含量低及味道鲜美等优点受到消费者青睐。然而其在贮藏过程中极易发生腐败变质,导致食用品质及经济价值大大降低。研究发现,微生物的生长代谢是导致水产品腐败变质的主要原因,而群体感应（Quorum sensing,QS）系统作为细菌间信息交流方式能够调节微生物的腐败表型。基于干扰QS系统策略,利用群体感应抑制剂（Quorum Sensing Inhibitors,QSIs）抑制水产品腐败微生物的致腐特性,为水产品保鲜提供了新途径。但是寻找QSIs的传统方法是随机的、耗时的、低效的,且一些已报道的QSIs抑制机理尚不明确。因此,本文以大菱鲆源温和气单胞菌（Aeromonas sobria）群体感应调控基因luxI/R为研究对象,通过同源建模、虚拟筛选、分子对接等方法更加高效地寻找具有潜力的新型QSIs,并对QSIs的抑制效果及机理进行探究,旨在深层次探究水产品腐败菌的QS机制及QSI邻氨基苯甲酸甲酯的抑制机理,为建立靶向控制QS系统为基础的水产品保鲜新技术提供实验依据。主要结论如下:1.利用分子生物学方法筛选与验证温和气单胞菌中QS调控基因...
【文章来源】：渤海大学辽宁省
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
革兰氏阴性菌LuxI/LuxR型系统
渤海大学硕士学位论文3子经寡肽通透酶系统（Opp）内化到细胞中，从而与转录因子结合，形成的复合物可以调节毒力因子的分泌[16]。此外，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）中也存在AIP介导的QS系统，以phrC编码的五肽CSF为信号分子。当达到一定浓度阈值时，CSF与组氨酸激酶ComP结合，从而激活转录因子，促进生物孢子形成[17]。图1-2金黄色葡萄球菌Agr型QS系统Fig.1-2AgrQSsysteminStaphylococcusaureus1.1.3细菌种间QS系统自诱导剂-2（Autoinducer-2,AI-2）信号分子是一种呋喃基硼酸二酯类化合物，通常以SAM为底物经S-核糖高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteinelyase,LuxS）催化而合成。LuxS/AI-2型QS系统是由AI-2信号分子介导的用于种属间信息交流的一种方式，广泛存在于革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间[18]。细菌通过识别AI-2信号分子感应环境中其它细菌的浓度来调节自身行为，从而在竞争中占有优势。这种现象最初发现于哈维氏弧菌（Vibrioharveryi）诱导生物发光的研究，该菌QS系统不仅可以产生AHLs，还可以产生AI-2信号分子[19]。当AI-2累积到一定阈值时，与感受因子LuxP结合，形成的复合物与传感器激酶LuxQ结合，诱导LuxQ转为磷酸酶状态，随后启动磷酸转移级联反应，最终激活luxCDABE的转录并发出生物荧光。研究发现，产气芽孢梭菌（Clostridiumperfringens）中外毒素的分泌，弯曲空肠杆菌（Campylobacterjejunmi）的运动性，出血性大肠杆菌（EscherichiacoliO157:H7）的毒素及运动性均受AI-2型QS系统调控。1.1.4其他QS系统除以上常见的QS系统外，在出血性大肠杆菌中发现了由AI-3信号分子介导的QseC/QseB双组份系统[20]。AI-3具有与肾上腺素和去肾上腺素相类似的结构特征。当达到一定浓度阈值时，AI-3与传感器激酶QseC结合，激活反应?
大菱鲆源温和气单胞菌群体感应luxI/luxR基因表达及其抑制剂的研究122.3.6.5信号肽预测使用SignalP4.1Server工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），选择NeuralNetworks和HiddenMarkovModels两种方法进行分析，参数设置为默认值。2.3.6.6亚细胞定位预测通过PSORTb软件和TaragetP1.1分析工具对LuxI/R蛋白进行亚细胞定位预测。2.3.6.7蛋白超家族预测将氨基酸序列提交至NCBI的保守结构域数据库（ConservedDomainDatabase,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行结构域分析。该数据库包括来源于不同数据库的保守结构域，每个结构域都有各自特有的模型，可以为保守结构域的位置及功能位点提供注释。2.3.6.8功能位点预测使用PROSITE分析工具（https://prosite.expasy.org/）进行分析，参数设置为默认值。2.3.6.9LuxI/R蛋白二级结构预测利用PSIPRED软件（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）进行分析，参数设为默认值。2.4结果与分析2.4.1温和气单胞菌群体感应调控基因luxI/luxR的验证温和气单胞菌由本实验室从腐败大菱鲆中分离获得，经过16sRNA测序及BLAST比对，发现其与NCBI数据库中温和气单胞菌（AeromonassobriaGX1）的相似性达99%。为了验证温和气单胞菌中是否含有LuxI/R同系物（luxI/luxR），使用设计的特异性引物进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。图2-1为温和气单胞菌luxI/luxR基因琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以观察到在预期大小处有明亮且单一的条带，且无引物二聚体出现。图2-1温和气单胞菌luxI/R基因特异性引物PCR扩增产物Fig.2-1ThePCRamplificationproductsofluxI/RspecificprimersofAeromonassobria2.4.2产物测序及序列比对
本文编号：3092045
【文章来源】：渤海大学辽宁省
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
革兰氏阴性菌LuxI/LuxR型系统
渤海大学硕士学位论文3子经寡肽通透酶系统（Opp）内化到细胞中，从而与转录因子结合，形成的复合物可以调节毒力因子的分泌[16]。此外，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）中也存在AIP介导的QS系统，以phrC编码的五肽CSF为信号分子。当达到一定浓度阈值时，CSF与组氨酸激酶ComP结合，从而激活转录因子，促进生物孢子形成[17]。图1-2金黄色葡萄球菌Agr型QS系统Fig.1-2AgrQSsysteminStaphylococcusaureus1.1.3细菌种间QS系统自诱导剂-2（Autoinducer-2,AI-2）信号分子是一种呋喃基硼酸二酯类化合物，通常以SAM为底物经S-核糖高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteinelyase,LuxS）催化而合成。LuxS/AI-2型QS系统是由AI-2信号分子介导的用于种属间信息交流的一种方式，广泛存在于革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间[18]。细菌通过识别AI-2信号分子感应环境中其它细菌的浓度来调节自身行为，从而在竞争中占有优势。这种现象最初发现于哈维氏弧菌（Vibrioharveryi）诱导生物发光的研究，该菌QS系统不仅可以产生AHLs，还可以产生AI-2信号分子[19]。当AI-2累积到一定阈值时，与感受因子LuxP结合，形成的复合物与传感器激酶LuxQ结合，诱导LuxQ转为磷酸酶状态，随后启动磷酸转移级联反应，最终激活luxCDABE的转录并发出生物荧光。研究发现，产气芽孢梭菌（Clostridiumperfringens）中外毒素的分泌，弯曲空肠杆菌（Campylobacterjejunmi）的运动性，出血性大肠杆菌（EscherichiacoliO157:H7）的毒素及运动性均受AI-2型QS系统调控。1.1.4其他QS系统除以上常见的QS系统外，在出血性大肠杆菌中发现了由AI-3信号分子介导的QseC/QseB双组份系统[20]。AI-3具有与肾上腺素和去肾上腺素相类似的结构特征。当达到一定浓度阈值时，AI-3与传感器激酶QseC结合，激活反应?
大菱鲆源温和气单胞菌群体感应luxI/luxR基因表达及其抑制剂的研究122.3.6.5信号肽预测使用SignalP4.1Server工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），选择NeuralNetworks和HiddenMarkovModels两种方法进行分析，参数设置为默认值。2.3.6.6亚细胞定位预测通过PSORTb软件和TaragetP1.1分析工具对LuxI/R蛋白进行亚细胞定位预测。2.3.6.7蛋白超家族预测将氨基酸序列提交至NCBI的保守结构域数据库（ConservedDomainDatabase,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行结构域分析。该数据库包括来源于不同数据库的保守结构域，每个结构域都有各自特有的模型，可以为保守结构域的位置及功能位点提供注释。2.3.6.8功能位点预测使用PROSITE分析工具（https://prosite.expasy.org/）进行分析，参数设置为默认值。2.3.6.9LuxI/R蛋白二级结构预测利用PSIPRED软件（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）进行分析，参数设为默认值。2.4结果与分析2.4.1温和气单胞菌群体感应调控基因luxI/luxR的验证温和气单胞菌由本实验室从腐败大菱鲆中分离获得，经过16sRNA测序及BLAST比对，发现其与NCBI数据库中温和气单胞菌（AeromonassobriaGX1）的相似性达99%。为了验证温和气单胞菌中是否含有LuxI/R同系物（luxI/luxR），使用设计的特异性引物进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。图2-1为温和气单胞菌luxI/luxR基因琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以观察到在预期大小处有明亮且单一的条带，且无引物二聚体出现。图2-1温和气单胞菌luxI/R基因特异性引物PCR扩增产物Fig.2-1ThePCRamplificationproductsofluxI/RspecificprimersofAeromonassobria2.4.2产物测序及序列比对
本文编号：3092045
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