绵羊eIF3h基因克

发布时间：2021-03-21 01:44

　　【目的】克隆绵羊真核翻译起始因子eI F3h,构建原核表达载体,并诱导外源蛋白表达,检测、鉴定带有His标签的目的蛋白。【方法】根据Genbank中绵羊eI F3h基因CDS序列设计引物,PCR特异扩增DNA片段,酶切、连接至pE T28α（+）载体,将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）株中诱导eI F3h蛋白表达。采用SDS-PAGE电泳分析目的蛋白表达情况,利用Western blot技术检测、鉴定目的蛋白。【结果】正确、完整的克隆到绵羊eI F3h基因CDS区序列,片段全长1 059 bp。将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）株后,在37℃,1 mmol/L浓度的IPTG诱导3.5 h后获得以包涵体形式存在的目的蛋白,分子量大小约为40 kD。【结论】获得了完整、正解的绵羊eI F3h基因CDS区序列片段,构建了该基因的原核表达载体,成功诱导了绵羊eI F3h基因外源表达的目的蛋白,为绵羊eI F3h基因的后续研究提供了科学数据。 

【文章来源】：新疆农业科学. 2017,54(02)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

重组表达质粒eIE3h－pET28α(+)

2期于常江等:绵羊eIF3h基因克垄原核表达及蛋白鉴定注:M为marker;1～2为eIE3h－pET28α(+)载体双酶切;3为eIE3h－pET28α(+);4为阴性对照Note:M，marker;1－2:DigestionproductsofeIE3h－pET28α(+)expressionvector;3，eIE3h－pET28α(+)expressionvector;4，Negativecontrol图3eIE3h－pET28α(+)质粒酶切Fig．3DigestionresultsofeIE3h－pET28α(+)expressionvector将重组质粒用EcoＲI、HindIII进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，得到大小约1000～1500bp范围内的片段。测序结果说明，重组质粒中插入的片段与Genbank中基因序列完全相同，原核表达载体构建成功。图3，图42．4eIF3h重组蛋白表达形式的鉴定筛癣鉴定出转化至E．coliBL21的阳性菌株，接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中。37℃过夜培养，以1∶100的稀释比例，将培养物重新接种于新培养基，培养物OD值达到0.6时，加入IPTG诱导3.5h。分别收集诱导培养物的上清和沉淀，SDS－PAGE电泳检测分析:外源诱导表达的重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀(图5、图6分别表示诱导的重组蛋白可溶及不溶部分)，上清未检测到重组表达的目的蛋白;在一定浓度范围内，蛋白量随IPTG浓度的增加而增加，与此同时蛋白量也随着诱导时间的延长而增多。图5，图6图4eIE3h基因序列部分测序图谱Fig．4ThesequencingmapofeIE3h2．5eIE3h重组蛋白的鉴定诱导后的大肠杆菌裂解后，对该沉淀包涵体蛋白进行Westernblot检测，查看所表达的蛋白是否为目的蛋白。结果显示:在37℃条件下，经0.8mmol/LIPTG诱导3.5h后收集的蛋白产物与抗体发生较明显的免疫反应，条带大小约为40kD(蛋白Marker未显示)，表明目的蛋白得到表达，该基因原核表达成功。图7389

行灾什晃榷ǎ??鞠凳??9.20，总平均亲水指数为－0.561;对该基因信号肽、疏水性及跨膜结构的分析发现，无信号肽，无跨膜结构(TMHMMServerv.2.0)，疏水性最大值为3.22，最小值为－3.83;抗原位点具有15个，推测具有较好的免疫原性。2．3eIE3h－pET28α(+)原核重组表达载体的构建用EcoＲI、HindIII分别双酶切纯化后的PCＲ产物片段及pET28α(+)质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶纯化后，再通过连接、转化，筛选重组子，使eIF3h基因CDS区段连接入pET28α(+)载体，并将重组载体命名为eIE3h－pET28α(+)，绘出结构示意。图2图2重组表达质粒eIE3h－pET28α(+)Fig．2ConstructionoftheeIE3h－pET28α(+)expressedplasmid388

【参考文献】：
硕士论文
[1]EIF3h蛋白表达及其基因多态性与结直肠癌相关性研究[D]. 吴继华.第三军医大学 2013



本文编号：3092073