基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的SCN1A-K0模型的RNA-seq分析

发布时间：2021-03-21 02:34

　　目的本次研究主要利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外建立SCN1A基因稳定敲除的细胞系并采用RNA-seq分析细胞的基因表达谱的变化。通过检测mRNA水平的变化分析SCN1A与DS发病之间的关联,并希望为Dravet综合症的治疗提供一些线索。方法①根据SCN1A启动子区序列设计sgRNA,并构建CRISPR/Cas9敲除质粒（pX459-SCN1A）。②将pX459-SCN1A质粒转染到N2a细胞系中,采用T7核酸内切酶I（T7E1）验证质粒活性。③将pX459-SCN1A质粒转染至HT22细胞系内,并构建单克隆细胞系。采用Western-Blot、QPCR检测SCN1A敲除效果。④选取SCN1A敲除效率最高的一组细胞系作为SCN1A-KO组,以HT22细胞系作为WT组。分别提取两组细胞系总RNA进行转录组测序分析。⑤对转录组测序原始数据进行质控、对比参考基因组并计算差异基因。将差异基因进行KEGG、GO富集以及蛋白质相互作用网络分析。选取部分差异基因进行QPCR验证。结果①对构建质粒进行测序分析显示,设计的三段sgRNA成功插入目的位点,表明质粒构建成功。②T7E1酶切验证显... 

【文章来源】：宁夏医科大学宁夏回族自治区

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【图文】：

图１质粒测序检测??经质粒测序检测，设计的３条ｓｇＲＮＡ已经正确插入质粒中

３单克隆细胞系构建??采用含８ｐｇ／ｍｌ的ＤＭＥＭ完全培养基进行筛选转然后的细胞，筛选７ｄ后荧光显微??镜下观察ＥＧＦＰ－ｐＸ４５９质粒转染细胞，结果显示，仅转染质粒的细胞存活（见图３）。从??筛选获得阳性细胞中挑选单个细胞进行扩增培养构建单克隆细胞系。??图３阳性细胞筛选??２６??

７差异基因分析??ＷＴ组和ＳＣＮ１Ａ－ＫＯ组相比较，满足差异塞因筛选条件的基：函：共１８６１个。与ＷＴ??组相比，ＳＣＮ１Ａ－ＫＯ缉有５７３个基因Ｊｉ调，１２８８个基囡下调（见图６）。??２８??


本文编号：3092150