猪瘟病毒结构蛋白E0基因打靶奶山羊的制备

发布时间：2021-03-26 03:29

　　猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种流行范围广、高度接触性的烈性传染病,是威胁养猪业的主要传染病之一。就现阶段而言,我国并未完全掌握彻底消灭猪瘟的方法。我国控制猪瘟病毒主要是采用传统疫苗。但由于猪瘟的流行形式发生了很大变化,已经不能对猪瘟起到很好的保护,因此,研究新型基因工程疫苗为大势所趋。猪瘟病毒结构蛋白E0（Classical swine fever virus,CSFV E0）可诱导机体产生中和抗体,从而使机体产生免疫。编码CSFV E0蛋白的核苷酸序列保守性相当高,因此CSFV E0蛋白可当成一种靶蛋白来防治猪瘟。本文利用TALEN基因打靶技术将含有猪瘟病毒结构蛋白E0基因的打靶载体定点整合到山羊β-乳球蛋白第一外显子中。在山羊乳腺上皮细胞中验证,其能够诱导表达猪瘟E0结构蛋白,这为以转CSFV E0基因的克隆细胞为供核细胞,进行核移植和胚胎移植来制备高效表达猪瘟病毒结构蛋白基因E0的山羊乳腺生物反应器奠定了基础。研究内容如下:1.CSFV E0基因在乳腺上皮细胞中的... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 猪瘟
        1.1.1 猪瘟的概述
        1.1.2 猪瘟的防控措施
    1.2 乳腺生物反应器
        1.2.1 乳腺生物反应器的概念
        1.2.2 乳腺生物反应器的研究进展
    1.3 基因编辑技术
        1.3.1 锌指核酸酶
        1.3.2 转录激活因子样效应物核酸酶
        1.3.3 RNA介导的工程核酸酶
第二章 利用TALEN介导猪瘟病毒结构蛋白E0基因在乳腺上皮细胞中表达
    2.1 实验材料
        2.1.1 载体及菌株
        2.1.2 实验试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 乳腺上皮细胞的分离培养
        2.2.2 细胞的转染与单克隆阳性细胞的筛选
        2.2.3 单克隆细胞中猪瘟E0（CSFV E0）基因整合位点的检测
        2.2.4 猪瘟病毒E0（CSFV E0）基因表达的PCR检测
        2.2.5 猪瘟病毒E0（CSFV E0）基因表达的定量PCR检测
        2.2.6 猪瘟病毒E0（CSFV E0）蛋白分泌表达检测
    2.3 实验结果
        2.3.1 山羊乳腺上皮细胞的分离纯化
        2.3.2 外源基因整合位点的检测
        2.3.3 PCR检测猪瘟病毒EO基因
        2.3.4 猪瘟病毒E0基因表达水平的检测
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 转猪瘟病毒E0基因打靶奶山羊的制备
    3.1 实验材料
        3.1.1 载体及细胞
        3.1.2 实验试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 组织块法培养山羊胎儿成纤维细胞及其冻存
        3.2.2 胎儿成纤维细胞的转染及克隆的筛选
        3.2.3 猪瘟E0基因在胎儿成纤维细胞中的整合检测
        3.2.4 转基因克隆胚的移植
        3.2.5 受体山羊的妊娠检测
        3.2.6 转基因小羊PCR鉴定
    3.3 实验结果
        3.3.1 山羊胎儿成纤维细胞的组织块培养及克隆的形成
        3.3.2 猪瘟病毒E0基因在胎儿成纤维细胞中的PCR鉴定
        3.3.3 转基因克隆胚胎的移植及检测
        3.3.4 转基因小羊PCR鉴定
    3.4 讨论
    3.5 小结
全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪瘟基因工程疫苗研究进展[J]. 李群,顾秀萍,钱钟,范娟,宋庆庆.  国外畜牧学(猪与禽). 2014(11)
[2]猪瘟疫苗的研究进展及ST细胞苗的研究现状[J]. 平玲,魏园园,王家敏,沈武玲,李倬,马忠仁,乔自.  当代畜禽养殖业. 2014(03)
[3]乳腺发育及泌乳相关miRNA研究进展[J]. 金晓露,杨建香,李真,刘红云,刘建新.  遗传. 2013(06)
[4]猪瘟病毒Erns在杆状病毒系统中的表达和纯化[J]. 罗雪莲,潘兹书.  氨基酸和生物资源. 2010(04)
[5]猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究[J]. 韩雪清,刘湘涛,张涌,谢庆阁,田波.  生物工程学报. 2002(02)

博士论文
[1]人乳铁蛋白基因定点敲入β乳球蛋白位点基因打靶奶山羊的研制[D]. 宋玉洁.西北农林科技大学 2015
[2]TALEN介导的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生产[D]. 崔趁趁.西北农林科技大学 2015



本文编号：3100859