家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因的克隆分析与剪接因子的功能初探
发布时间：2021-04-02 17:33
微孢子虫（Microsporidia）是寄生范围广的单细胞真核生物,家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是家蚕主要的传染性疾病微粒子病的病原体,给蚕业造成巨大的经济损失。家蚕微孢子虫体内没有三羧酸循环,但具有糖酵解（Glycolysis）途径。糖酵解过程中有三个关键反应,分别是葡萄糖在己糖激酶的作用下转化为6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖在磷酸果糖激酶的作用下转化为1,6-二磷酸果糖以及磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶（Pyruvate kinase）的作用下转化为丙酮酸,这三步均是不可逆反应。剪接因子（Splicing factor）是真核生物中RNA编辑的重要元件,经过剪接因子剪接可以产生许多具有功能的、带有编码信息的mRNA,对于生物体最基本的生命活动至关重要,同时对于真核生物基因正确表达相应蛋白也是不可或缺的一步。本课题对家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因和剪接因子基因及二者所编码的蛋白质做了研究,得到如下结果:（1）通过检索发现家蚕微孢子虫的丙酮酸激酶共有两个亚型,每个亚型各有3个拷贝。系统发育树和多序列比对结果的表明,家蚕微孢子虫丙酮酸激酶M2亚型的其中两个拷贝（EOB11679...
【文章来源】：江苏科技大学江苏省
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 微孢子虫
1.2 微孢子虫糖酵解途径研究现状
1.3 剪接因子研究现状
1.4 研究意义
1.5 技术路线
第2章 家蚕微孢子虫丙酮酸激酶的基因克隆与转录活性分析
2.1 材料与试剂
2.1.1 实验材料和试剂
2.1.2 实验仪器
2.1.3 主要试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 NbPK-2基因克隆
2.2.3 NbPK-2转录活性分析
2.3 结果与分析
2.3.1 生物信息学分析结果
2.3.2 NbPK-2基因克隆结果
2.3.3 q-PCR测定微孢子虫感染家蚕后不同时间段的NbPK-2 基因转录水平
2.4 讨论
第3章 家蚕微孢子虫的剪接因子的基因克隆与转录活性分析
3.1 材料与试剂
3.1.1 实验材料和试剂
3.1.2 实验仪器
3.1.3 主要试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 生物信息学分析
3.2.2 NbSF-1基因克隆
3.2.3 NbSF-1转录活性分析
3.3 结果与分析
3.3.1 生物信息学分析结果
3.3.2 NbSF-1基因克隆结果
3.3.3 q-PCR测定微孢子虫感染家蚕后不同时间段的NbSF-1 基因转录水平
3.4 讨论
第4章 家蚕微孢子虫剪接因子的原核表达以及多克隆抗体的制备
4.1 材料与试剂
4.1.1 实验材料与试剂
4.1.2 实验仪器
4.1.3 主要试剂配制
4.2 实验方法
4.2.1 构建重组表达载体
4.2.2 小试表达目的蛋白
4.2.3 SDS-PAGE检测蛋白表达
4.2.4 大量表达并纯化目的蛋白
4.2.5 制备多克隆抗体
4.2.6 家蚕微孢子虫的总蛋白的提取
4.3 结果与分析
4.4 讨论
第5章 家蚕微孢子虫剪接因子的亚细胞定位
5.1 材料及试剂
5.1.1 实验材料与试剂
5.1.2 实验仪器
5.1.3 主要试剂配制
5.2 试验方法
5.2.1 间接免疫荧光实验
5.3 结果与分析
5.4 讨论
结论
参考文献
附录
附录1 糖酵解模式图
附录2 pMD-19T载体质粒图谱
附录3 pET-28a载体质粒图谱
附录4 家蚕微孢子虫丙酮酸激酶序列比对分析图
附录5 家蚕微孢子虫剪接因子序列比对分析图
附录6 实验所用仪器汇总
注释
攻读硕士期间已发表论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]怀黄菊CmPAN基因的克隆与表达分析[J]. 赵喜亭,刘克,朱玉婷,马孟丹,吕萌,宋灵雨,蒋丽微,王苗,李明军. 农业生物技术学报. 2019(04)
[2]数据分析之单因素方差分析[J]. 牛凯. 产业与科技论坛. 2019(02)
[3]miRNA对虎龙斑补偿生长及非特异性免疫的影响研究[J]. 柳小春,秦慧,肖诗强,张海发,杨宇晴,刘苏,石和荣,赵会宏. 海南热带海洋学院学报. 2019(02)
[4]家蚕orcokinin基因的选择性剪接与表达分析[J]. 王平阳,赵巧玲,裘智勇,沈兴家,夏定国. 蚕业科学. 2018(06)
[5]野桑蚕br-c基因的克隆与序列分析[J]. 凌君,楚渠,彭云武. 湖南农业科学. 2018(10)
[6]反式剪接及其在哺乳动物中的作用[J]. 荆晓燕,张彩霞,宋艳芳,刘东宇,刘娣,杨秀芹. 畜牧兽医学报. 2018(10)
[7]家蚕微孢子虫极管蛋白1（NbPTP1）在果蝇S2细胞中的表达与糖基化修饰[J]. 龙梦娴,谭瑶瑶,刘柯柯,吴玉娇,吕青,潘国庆,周泽扬. 生物工程学报. 2018(09)
[8]玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26两个可变剪接体的功能分析[J]. 张盼娃,张夏玮,于好强,盘林秀,付凤玲,李晚忱. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2018(07)
[9]SPSS中单因素方差分析的运用[J]. 何成. 农业网络信息. 2018(01)
[10]鳞翅目昆虫病原微孢子虫研究进展[J]. 梁喜丽,鲁兴萌,邵勇奇. 微生物学报. 2018(06)
博士论文
[1]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）休眠孢子和发芽孢子转录组、蛋白质组定量差异分析及NbRBL蛋白功能的初步研究[D]. 刘涵.浙江大学 2016
[2]一种大豆固有无序蛋白-GmASR蛋白的多重保护功能研究[D]. 李冉辉.东北师范大学 2013
[3]柞蚕微孢子虫检测及感染柞蚕中肠转录组及蛋白质组学研究[D]. 姜义仁.沈阳农业大学 2012
[4]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究[D]. 党晓群.西南大学 2012
[5]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究[D]. 林立鹏.西南大学 2012
[6]微孢子虫感染家蚕相关基因的研究[D]. 邱海洪.浙江大学 2012
[7]二种大豆LEA4蛋白的金属离子结合特性及对生物大分子的保护作用[D]. 刘国宝.东北师范大学 2011
[8]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）基因组学研究[D]. 刘含登.西南大学 2011
[9]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）线粒体相关基因研究[D]. 胡军华.西南大学 2008
[10]家蚕微孢子（Nosema bombycis）全基因组结构与系统进化分析[D]. 许金山.西南大学 2007
硕士论文
[1]家蚕BmYki不同剪接体的功能研究[D]. 陆亚红.苏州大学 2016
[2]微孢子虫感染诱导的家蚕应答反应及对其免疫信号通路的激活[D]. 乐亚杰.江苏科技大学 2015
[3]克雷伯肺炎杆菌葡萄糖氧化途径的研究[D]. 王德信.燕山大学 2015
[4]家蚕正常蚕卵与感染微孢子虫蚕卵的差异蛋白质研究[D]. 姜春宝.重庆师范大学 2012
[5]全原子编码方式预测蛋白质的溶剂可及性[D]. 张晓朦.大连理工大学 2011
[6]家蚕微孢子虫与菜粉蝶微孢子虫的形态学与系统发育研究[D]. 徐小芳.江苏科技大学 2011
[7]家蚕微粒子病免疫学快速检测试纸条的研制[D]. 芦琨.西南大学 2009
[8]家蚕微孢子虫在昆虫细胞中的增殖及CQ1株系建立的研究[D]. 贺伟伟.西南大学 2009
[9]家蚕微孢子虫CQ1分离株的遗传多态性研究[D]. 申子刚.西南大学 2008
[10]野油菜黄单胞菌EMP途径相关基因的突变分析[D]. 胡江如.广西大学 2007
本文编号：3115668
【文章来源】：江苏科技大学江苏省
【文章页数】：94 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 微孢子虫
1.2 微孢子虫糖酵解途径研究现状
1.3 剪接因子研究现状
1.4 研究意义
1.5 技术路线
第2章 家蚕微孢子虫丙酮酸激酶的基因克隆与转录活性分析
2.1 材料与试剂
2.1.1 实验材料和试剂
2.1.2 实验仪器
2.1.3 主要试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 NbPK-2基因克隆
2.2.3 NbPK-2转录活性分析
2.3 结果与分析
2.3.1 生物信息学分析结果
2.3.2 NbPK-2基因克隆结果
2.3.3 q-PCR测定微孢子虫感染家蚕后不同时间段的NbPK-2 基因转录水平
2.4 讨论
第3章 家蚕微孢子虫的剪接因子的基因克隆与转录活性分析
3.1 材料与试剂
3.1.1 实验材料和试剂
3.1.2 实验仪器
3.1.3 主要试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 生物信息学分析
3.2.2 NbSF-1基因克隆
3.2.3 NbSF-1转录活性分析
3.3 结果与分析
3.3.1 生物信息学分析结果
3.3.2 NbSF-1基因克隆结果
3.3.3 q-PCR测定微孢子虫感染家蚕后不同时间段的NbSF-1 基因转录水平
3.4 讨论
第4章 家蚕微孢子虫剪接因子的原核表达以及多克隆抗体的制备
4.1 材料与试剂
4.1.1 实验材料与试剂
4.1.2 实验仪器
4.1.3 主要试剂配制
4.2 实验方法
4.2.1 构建重组表达载体
4.2.2 小试表达目的蛋白
4.2.3 SDS-PAGE检测蛋白表达
4.2.4 大量表达并纯化目的蛋白
4.2.5 制备多克隆抗体
4.2.6 家蚕微孢子虫的总蛋白的提取
4.3 结果与分析
4.4 讨论
第5章 家蚕微孢子虫剪接因子的亚细胞定位
5.1 材料及试剂
5.1.1 实验材料与试剂
5.1.2 实验仪器
5.1.3 主要试剂配制
5.2 试验方法
5.2.1 间接免疫荧光实验
5.3 结果与分析
5.4 讨论
结论
参考文献
附录
附录1 糖酵解模式图
附录2 pMD-19T载体质粒图谱
附录3 pET-28a载体质粒图谱
附录4 家蚕微孢子虫丙酮酸激酶序列比对分析图
附录5 家蚕微孢子虫剪接因子序列比对分析图
附录6 实验所用仪器汇总
注释
攻读硕士期间已发表论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]怀黄菊CmPAN基因的克隆与表达分析[J]. 赵喜亭,刘克,朱玉婷,马孟丹,吕萌,宋灵雨,蒋丽微,王苗,李明军. 农业生物技术学报. 2019(04)
[2]数据分析之单因素方差分析[J]. 牛凯. 产业与科技论坛. 2019(02)
[3]miRNA对虎龙斑补偿生长及非特异性免疫的影响研究[J]. 柳小春,秦慧,肖诗强,张海发,杨宇晴,刘苏,石和荣,赵会宏. 海南热带海洋学院学报. 2019(02)
[4]家蚕orcokinin基因的选择性剪接与表达分析[J]. 王平阳,赵巧玲,裘智勇,沈兴家,夏定国. 蚕业科学. 2018(06)
[5]野桑蚕br-c基因的克隆与序列分析[J]. 凌君,楚渠,彭云武. 湖南农业科学. 2018(10)
[6]反式剪接及其在哺乳动物中的作用[J]. 荆晓燕,张彩霞,宋艳芳,刘东宇,刘娣,杨秀芹. 畜牧兽医学报. 2018(10)
[7]家蚕微孢子虫极管蛋白1（NbPTP1）在果蝇S2细胞中的表达与糖基化修饰[J]. 龙梦娴,谭瑶瑶,刘柯柯,吴玉娇,吕青,潘国庆,周泽扬. 生物工程学报. 2018(09)
[8]玉米蛋白磷酸酶2C基因ZmPP2C26两个可变剪接体的功能分析[J]. 张盼娃,张夏玮,于好强,盘林秀,付凤玲,李晚忱. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2018(07)
[9]SPSS中单因素方差分析的运用[J]. 何成. 农业网络信息. 2018(01)
[10]鳞翅目昆虫病原微孢子虫研究进展[J]. 梁喜丽,鲁兴萌,邵勇奇. 微生物学报. 2018(06)
博士论文
[1]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）休眠孢子和发芽孢子转录组、蛋白质组定量差异分析及NbRBL蛋白功能的初步研究[D]. 刘涵.浙江大学 2016
[2]一种大豆固有无序蛋白-GmASR蛋白的多重保护功能研究[D]. 李冉辉.东北师范大学 2013
[3]柞蚕微孢子虫检测及感染柞蚕中肠转录组及蛋白质组学研究[D]. 姜义仁.沈阳农业大学 2012
[4]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究[D]. 党晓群.西南大学 2012
[5]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究[D]. 林立鹏.西南大学 2012
[6]微孢子虫感染家蚕相关基因的研究[D]. 邱海洪.浙江大学 2012
[7]二种大豆LEA4蛋白的金属离子结合特性及对生物大分子的保护作用[D]. 刘国宝.东北师范大学 2011
[8]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）基因组学研究[D]. 刘含登.西南大学 2011
[9]家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）线粒体相关基因研究[D]. 胡军华.西南大学 2008
[10]家蚕微孢子（Nosema bombycis）全基因组结构与系统进化分析[D]. 许金山.西南大学 2007
硕士论文
[1]家蚕BmYki不同剪接体的功能研究[D]. 陆亚红.苏州大学 2016
[2]微孢子虫感染诱导的家蚕应答反应及对其免疫信号通路的激活[D]. 乐亚杰.江苏科技大学 2015
[3]克雷伯肺炎杆菌葡萄糖氧化途径的研究[D]. 王德信.燕山大学 2015
[4]家蚕正常蚕卵与感染微孢子虫蚕卵的差异蛋白质研究[D]. 姜春宝.重庆师范大学 2012
[5]全原子编码方式预测蛋白质的溶剂可及性[D]. 张晓朦.大连理工大学 2011
[6]家蚕微孢子虫与菜粉蝶微孢子虫的形态学与系统发育研究[D]. 徐小芳.江苏科技大学 2011
[7]家蚕微粒子病免疫学快速检测试纸条的研制[D]. 芦琨.西南大学 2009
[8]家蚕微孢子虫在昆虫细胞中的增殖及CQ1株系建立的研究[D]. 贺伟伟.西南大学 2009
[9]家蚕微孢子虫CQ1分离株的遗传多态性研究[D]. 申子刚.西南大学 2008
[10]野油菜黄单胞菌EMP途径相关基因的突变分析[D]. 胡江如.广西大学 2007
本文编号：3115668
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