大豆Lunasin基因的过表达和Lunasin多肽对人乳腺癌细胞增殖抑制机理初探
发布时间：2021-04-06 13:52
Lunasin,是从大豆中分离获得的新型天然多肽,分子量为5.0 KD左右,含有44个氨基酸;具有多种功能活性,应用前景广阔。但天然来源的Lunasin多肽含量极低,化学合成成本较高,如何高效获得Lunasin多肽是需要攻克的难题。随着分子生物学与基因工程的发展,利用DNA重组技术高效合成Lunasin多肽使这一设想成为可能。转基因大豆是目前世界上种植范围最广泛的遗传修饰农作物,通过基因工程技术获取优良转基因大豆的手段日趋成熟。本研究利用农杆菌介导的大豆遗传转化,将大豆内源基因Lunasin多肽编码基因转入其基因组中,由35S强启动子启动基因过量表达,筛选高Lunasin含量的转基因大豆株系,建立转基因大豆功能活性评价体系,结合转录组和蛋白质组学分析揭示Lunasin多肽抗癌分子机制。取得以下实验进展:1.转基因大豆的获得:采用农杆菌介导的遗传转化将Lunasin多肽编码基因转入大豆基因组中,目前已获得15个独立的T1代转基因大豆株系。建立了Lunasin多肽高效液相色谱串联质谱联用分析方法,Lunasin多肽在保留时间10.606 min时出峰,其一级质谱分析可检测到多个母离子信号,...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：89 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Lunasin多肽的一级结构序列及功能示意图(Hernándezledesmaetal.,2009)
中国农业科学院博士学位论文第一章引言10化能力；选用脂多糖LPS诱发的小鼠巨噬细胞RAW26.7炎症反应为试验模型，检测Lunasin多肽富集物对炎症反应的抑制能力。人乳腺癌细胞MDA-MB-231是广泛应用于癌症机理研究、靶标信号传导和功能营养等方面的一类细胞株，因此可通过分析Lunasin多肽富集物对MDA-MB-231细胞增值的抑制情况来评估其抗癌活性。通过细胞免疫荧光染色对Lunasin多肽进行亚细胞定位分析，了解Lunasin多肽在哺乳动物细胞内发挥功能时的具体部位。3.选用人乳腺癌细胞MDA-MB-231模型，综合应用转录组和蛋白质组测序技术，全面分析Lunasin处理前后细胞内基因表达调控，分析蛋白间的相互作用，筛选差异基因、差异蛋白，进行GO/KEGG富集分析，挖掘其抗癌核心调控网络。1.8.2技术路线图1-2实验技术路线示意图Fig.1-2Schematicdiagramofexperimentaltechnicalroute
中国农业科学院博士学位论文第二章Lunasin过表达转基因大豆的获得及其分子生物学分析1680%B，23min80%B，24min5%B，30min5%B。质谱型号为飞行时间质谱（TripleTOF6600），离子源为电喷雾离子源（ESI源），采用IDA模式对样品进行检测，样品经离子化后进行TOF-MS一级扫描（扫描范围为200-2000Da）和TOF-MS/MS子离子扫描（扫描范围为50-2000Da）。离子源温度为550℃，雾化气Gas1为50psi，以氮气作为辅助加热气Gas2（50psi），气帘气为35psi，离子采集模式为正离子模式。2.3结果与分析2.3.1转基因大豆的获得通过对大豆愈伤组织的抗性筛选及PCR鉴定，我们获得了15个独立的转基因大豆株系。如图2-1所示为大豆遗传转化载体构建示意图，Lunasin编码基因由35S强启动子启动表达；另外，在农杆菌T-DNA区域含有草甘膦抗性筛选（EPSPS），由Tsf启动子控制表达，便于转基因材料的初步确定。图2-2所示为大豆遗传转化详细过程：(a)挑选颗粒饱满的大豆种子进行萌发试验；(b)农杆菌侵染；(c)农杆菌与下胚轴共培养；(d)愈伤组织的抗性筛眩(e)胚性抗性愈伤诱导过程，诱导其分化，生根、发芽。(f)植株再生，获得转基因大豆。图2-1载体构建示意图Fig.2-1Vectorconstruction图2-2大豆遗传转化Fig.2-2Genetictransformationofsoybean图2-2（a）大豆萌发，获取大豆下胚轴；2-2（b）农杆菌侵染外植体；（c）农杆菌与下胚轴共培养；（d）愈伤组织抗性筛选；（e）胚性抗性愈伤诱导分化；（f）植株再生。2-2(a)Soybeanseedswereselectedtogerminatefortheexplants.(b)Agrobacteriuminfection.(c)Co-cultureofexplantsandagrobacteria.(d)Resistancescreeningofcallus.(e)Inductiondifferentiationofthecallus.(f)Plantletregeneration.
【参考文献】：
期刊论文
[1]全球转基因大豆发展概况[J]. 谭巍巍,王永斌,赵远玲,刘昭军,王广金. 大豆科技. 2019(04)
[2]组蛋白泛素化与去泛素化对染色质和基因表达的研究进展[J]. 林烨,裴培,王珊. 现代生物医学进展. 2019(08)
[3]DNA测序技术的发展进程[J]. 毛亚文,陈江华. 亚热带植物科学. 2018(01)
[4]细胞凋亡途径的研究进展[J]. 李帅,张炳东. 山东医药. 2017(37)
[5]基于稳定同位素标记和平行反应监测的蛋白质组学定量技术用于肝癌生物标志物的筛选和验证[J]. 王素兰,高华萍,张菁,叶翔. 色谱. 2017(09)
[6]乳腺癌血清标志物的TMT标记定量蛋白质组学筛选及分析[J]. 李曦洲,方敏,盛湲,于恩达. 第二军医大学学报. 2017(05)
[7]抗肿瘤多肽药物的作用机制及研究进展[J]. 王淑静,刘欢,赵建凯,任爽,孙薇薇,张文君,张家宁,张寒. 药学研究. 2016(12)
[8]大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展[J]. 祁浩,刘新利. 安徽农业科学. 2016(17)
[9]转基因大豆研究及应用进展[J]. 崔宁波,张正岩. 西北农业学报. 2016(08)
[10]莲房原花青素通过线粒体介导的内源性Caspase途径诱导HepG2细胞凋亡[J]. 段玉清,许慧,曲文娟,罗孝平,赵彬,李盼,张海辉. 现代食品科技. 2016(09)
博士论文
[1]溶酶体介导肿瘤获得性耐药的机制及大环双联苄类化合物的干预作用和靶点分析[D]. 牛焕民.山东大学 2019
[2]dcf1抑制人源脑胶质瘤细胞自噬与凋亡的信号机制研究[D]. 骆光洪.上海大学 2018
[3]阿托伐他汀通过溶酶体—线粒体轴抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的机制[D]. 常野.中国医科大学 2018
[4]真核生物DNA复制解旋酶MCM的结构研究[D]. 成二超.清华大学 2017
[5]长牡蛎内源性细胞凋亡通路及VDAC2基因功能的研究[D]. 李颖翔.中国科学院大学(中国科学院海洋研究所) 2016
[6]组蛋白甲基化与DNA甲基化的相互作用及其表观遗传机制的研究[D]. 陈香嵩.华中农业大学 2012
[7]氧化应激诱导宫颈癌细胞死亡过程中溶酶体—线粒体途径的作用机制[D]. 刘玉和.吉林大学 2009
[8]不同程度脑外伤后Bcl-2、Bax、Caspase-1、Caspase-3,NF-κB表达变化与细胞凋亡及其相互关系的实验研究[D]. 陶陆阳.中国医科大学 2003
硕士论文
[1]丙酮酸乙酯对慢性脑缺血大鼠凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响[D]. 王凯.山西医科大学 2019
[2]Hsp90抑制剂17-DMAG通过自噬-溶酶体途径诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的机制研究[D]. 马秀娟.中国医科大学 2019
[3]不同种芦荟植物化学物组成及抗紫外损伤机理探究[D]. 赖沁润.华南理工大学 2016
[4]人工合成基因重组肽rLj-RGD4对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用[D]. 时春风.辽宁师范大学 2016
[5]含RGD序列多肽靶向结合整合素αvβ3的分子基础研究[D]. 俞玉萍.浙江大学 2014
[6]大豆下胚轴再生体系的优化及HaBADH转化的初步研究[D]. 郭秋云.南京农业大学 2013
[7]农杆菌介导棉花遗传转化体系优化[D]. 刘明月.上海交通大学 2011
[8]大豆生物活性肽功能研究-Lunasin原核表达纯化及活性鉴定[D]. 盖文丽.华中科技大学 2010
[9]大豆多肽及其生物活性的研究[D]. 荣建华.华中农业大学 2001
本文编号：3121555
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：89 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Lunasin多肽的一级结构序列及功能示意图(Hernándezledesmaetal.,2009)
中国农业科学院博士学位论文第一章引言10化能力；选用脂多糖LPS诱发的小鼠巨噬细胞RAW26.7炎症反应为试验模型，检测Lunasin多肽富集物对炎症反应的抑制能力。人乳腺癌细胞MDA-MB-231是广泛应用于癌症机理研究、靶标信号传导和功能营养等方面的一类细胞株，因此可通过分析Lunasin多肽富集物对MDA-MB-231细胞增值的抑制情况来评估其抗癌活性。通过细胞免疫荧光染色对Lunasin多肽进行亚细胞定位分析，了解Lunasin多肽在哺乳动物细胞内发挥功能时的具体部位。3.选用人乳腺癌细胞MDA-MB-231模型，综合应用转录组和蛋白质组测序技术，全面分析Lunasin处理前后细胞内基因表达调控，分析蛋白间的相互作用，筛选差异基因、差异蛋白，进行GO/KEGG富集分析，挖掘其抗癌核心调控网络。1.8.2技术路线图1-2实验技术路线示意图Fig.1-2Schematicdiagramofexperimentaltechnicalroute
中国农业科学院博士学位论文第二章Lunasin过表达转基因大豆的获得及其分子生物学分析1680%B，23min80%B，24min5%B，30min5%B。质谱型号为飞行时间质谱（TripleTOF6600），离子源为电喷雾离子源（ESI源），采用IDA模式对样品进行检测，样品经离子化后进行TOF-MS一级扫描（扫描范围为200-2000Da）和TOF-MS/MS子离子扫描（扫描范围为50-2000Da）。离子源温度为550℃，雾化气Gas1为50psi，以氮气作为辅助加热气Gas2（50psi），气帘气为35psi，离子采集模式为正离子模式。2.3结果与分析2.3.1转基因大豆的获得通过对大豆愈伤组织的抗性筛选及PCR鉴定，我们获得了15个独立的转基因大豆株系。如图2-1所示为大豆遗传转化载体构建示意图，Lunasin编码基因由35S强启动子启动表达；另外，在农杆菌T-DNA区域含有草甘膦抗性筛选（EPSPS），由Tsf启动子控制表达，便于转基因材料的初步确定。图2-2所示为大豆遗传转化详细过程：(a)挑选颗粒饱满的大豆种子进行萌发试验；(b)农杆菌侵染；(c)农杆菌与下胚轴共培养；(d)愈伤组织的抗性筛眩(e)胚性抗性愈伤诱导过程，诱导其分化，生根、发芽。(f)植株再生，获得转基因大豆。图2-1载体构建示意图Fig.2-1Vectorconstruction图2-2大豆遗传转化Fig.2-2Genetictransformationofsoybean图2-2（a）大豆萌发，获取大豆下胚轴；2-2（b）农杆菌侵染外植体；（c）农杆菌与下胚轴共培养；（d）愈伤组织抗性筛选；（e）胚性抗性愈伤诱导分化；（f）植株再生。2-2(a)Soybeanseedswereselectedtogerminatefortheexplants.(b)Agrobacteriuminfection.(c)Co-cultureofexplantsandagrobacteria.(d)Resistancescreeningofcallus.(e)Inductiondifferentiationofthecallus.(f)Plantletregeneration.
【参考文献】：
期刊论文
[1]全球转基因大豆发展概况[J]. 谭巍巍,王永斌,赵远玲,刘昭军,王广金. 大豆科技. 2019(04)
[2]组蛋白泛素化与去泛素化对染色质和基因表达的研究进展[J]. 林烨,裴培,王珊. 现代生物医学进展. 2019(08)
[3]DNA测序技术的发展进程[J]. 毛亚文,陈江华. 亚热带植物科学. 2018(01)
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[5]基于稳定同位素标记和平行反应监测的蛋白质组学定量技术用于肝癌生物标志物的筛选和验证[J]. 王素兰,高华萍,张菁,叶翔. 色谱. 2017(09)
[6]乳腺癌血清标志物的TMT标记定量蛋白质组学筛选及分析[J]. 李曦洲,方敏,盛湲,于恩达. 第二军医大学学报. 2017(05)
[7]抗肿瘤多肽药物的作用机制及研究进展[J]. 王淑静,刘欢,赵建凯,任爽,孙薇薇,张文君,张家宁,张寒. 药学研究. 2016(12)
[8]大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展[J]. 祁浩,刘新利. 安徽农业科学. 2016(17)
[9]转基因大豆研究及应用进展[J]. 崔宁波,张正岩. 西北农业学报. 2016(08)
[10]莲房原花青素通过线粒体介导的内源性Caspase途径诱导HepG2细胞凋亡[J]. 段玉清,许慧,曲文娟,罗孝平,赵彬,李盼,张海辉. 现代食品科技. 2016(09)
博士论文
[1]溶酶体介导肿瘤获得性耐药的机制及大环双联苄类化合物的干预作用和靶点分析[D]. 牛焕民.山东大学 2019
[2]dcf1抑制人源脑胶质瘤细胞自噬与凋亡的信号机制研究[D]. 骆光洪.上海大学 2018
[3]阿托伐他汀通过溶酶体—线粒体轴抑制血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的机制[D]. 常野.中国医科大学 2018
[4]真核生物DNA复制解旋酶MCM的结构研究[D]. 成二超.清华大学 2017
[5]长牡蛎内源性细胞凋亡通路及VDAC2基因功能的研究[D]. 李颖翔.中国科学院大学(中国科学院海洋研究所) 2016
[6]组蛋白甲基化与DNA甲基化的相互作用及其表观遗传机制的研究[D]. 陈香嵩.华中农业大学 2012
[7]氧化应激诱导宫颈癌细胞死亡过程中溶酶体—线粒体途径的作用机制[D]. 刘玉和.吉林大学 2009
[8]不同程度脑外伤后Bcl-2、Bax、Caspase-1、Caspase-3,NF-κB表达变化与细胞凋亡及其相互关系的实验研究[D]. 陶陆阳.中国医科大学 2003
硕士论文
[1]丙酮酸乙酯对慢性脑缺血大鼠凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响[D]. 王凯.山西医科大学 2019
[2]Hsp90抑制剂17-DMAG通过自噬-溶酶体途径诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的机制研究[D]. 马秀娟.中国医科大学 2019
[3]不同种芦荟植物化学物组成及抗紫外损伤机理探究[D]. 赖沁润.华南理工大学 2016
[4]人工合成基因重组肽rLj-RGD4对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用[D]. 时春风.辽宁师范大学 2016
[5]含RGD序列多肽靶向结合整合素αvβ3的分子基础研究[D]. 俞玉萍.浙江大学 2014
[6]大豆下胚轴再生体系的优化及HaBADH转化的初步研究[D]. 郭秋云.南京农业大学 2013
[7]农杆菌介导棉花遗传转化体系优化[D]. 刘明月.上海交通大学 2011
[8]大豆生物活性肽功能研究-Lunasin原核表达纯化及活性鉴定[D]. 盖文丽.华中科技大学 2010
[9]大豆多肽及其生物活性的研究[D]. 荣建华.华中农业大学 2001
本文编号：3121555
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3121555.html
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