用于生物合成戊二胺的新的L-赖氨酸脱羧酶基因的功能鉴定和突变研究
发布时间：2021-04-07 22:49
L-赖氨酸脱羧酶（L-lysine decarboxylase EC 4.1.1.18）是生物体内催化L-赖氨酸发生脱羧反应生成戊二胺的高度专一性酶,需要磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate,PLP）作为辅因子。该酶是生物法合成戊二胺体系中的关键酶。目前,L-赖氨酸脱羧酶酶活力不高、稳定性较差等原因是生物合成体系效率低下的瓶颈问题。因此,从环境微生物中挖掘新型且具有优良特性的L-赖氨酸脱羧酶,具有重要的现实意义和工业应用价值。本研究中采用直接提取法构建了亚热带山区富含有机质土壤的宏基因组文库。基于功能筛选策略,从文库中筛选到1个新的L-赖氨酸脱羧酶基因ldc1E（GenBank登录号:KX463450）,序列分析、功能域分析以及进化关系分析结果表明Ldc1E属于III型磷酸吡哆醛依赖型脱羧酶和天冬氨酸氨基转移酶超家族。目前,国际上暂未发现利用宏基因组学技术完成新的L-赖氨酸脱羧酶基因功能研究的报道。对ldc1E基因进行克隆,实现其在大肠杆菌表达系统中过量表达,采用Ni-NTA亲和层析和超滤脱盐处理,得到了纯度较高的Ldc1E蛋白。产物鉴定结果表明:Ldc1E具有催化L-赖...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：176 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
L-赖氨酸脱羧酶反应示意图
广西大学博士学位论文用于生物合成戊二胺的新的L-赖氨酸脱羧酶基因的功能鉴定和突变研究2中cadA基因编码酸诱导型L-赖氨酸脱羧酶CadA，cadB基因编码戊二胺转运蛋白CadB，可将CadA蛋白分泌至胞外，cadC基因编码的CadC属于调控蛋白[12,13]。当细胞处于低pH和L-赖氨酸浓度较高的时候，cadC基因被激活，表达产物作用于Pcad，开始合成CadA和CadB蛋白[14,15]。有研究表明在cadC基因上游发现的lysP基因编码的赖氨酸渗透酶LysP对CadC的活性有抑制作用[16]。此外，当细胞内戊二胺的含量较高时可以与CadC结合，抑制其活性，降低cadBA操纵子的转录水平；还可以使细胞膜孔蛋白关闭，影响细胞生长[17,18]。图1-2大肠杆菌中CadBA操纵子的调控模型[11]Fig.1-2TheregulationmodelofCadoperoninE.coli.目前，来源于大肠杆菌（Escherichiacoli）中的L-赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC的酶学特性研究的较为清楚。其中，LdcC在较宽泛的pH值范围内有活性，最适pH值为7.6，而CadA的最适pH值为5.5；LdcC和CadA在温度为52°C条件下活性最高，从热稳定性方面来说，LdcC的热稳定性相对较好；在底物亲和力上，LdcC与CadA对底物的亲和力相当[19]。有文献报道，来源于肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）中的L-赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC的最适作用温度为37°C，最适作用pH为7.0，和大肠杆菌来源的L-赖
广西大学博士学位论文用于生物合成戊二胺的新的L-赖氨酸脱羧酶基因的功能鉴定和突变研究4图1-3L-赖氨酸脱羧酶的二聚体结构[33]Fig.1-3ThestructureofL-lysinedecarboxylasedimer.L-赖氨酸脱羧酶单体结构可以分为五个部分：Wing结构（红色）、Linker结构（橘色）、PLP-SD结构（黄色）、SD4结构（绿色）以及CTD结构（蓝色）[33]。单体结构不具有催化活性，只有当两个单体结合成二聚体时才形成完整的活性中心，即活性中心位于两个单体结合时的接触面。辅因子PLP上的磷酸基团可以与二聚体中的单体1上的T220、S221、S364、H366残基之间形成氢键作用，与单体2上的T398、T399以及S400残基之间形成氢键作用。PLP吡哆环上的N1可以与D330残基侧链的羧基之间形成盐键[34]。His245的咪唑基团与PLP吡哆环的re面平行，有助于催化过程中醌型中间体的形成[35]。L-赖氨酸脱羧酶的二聚体可以作为一个结构单元，通过5个结构单元结合形成十聚合体结构，十聚合体结构中有10个活性中心，可以同时发生催化反应。底物分子进入酶活性中心的通道推测是由CTD结构组成，该通道中含有大量带负电荷的Glu残基，推测其可能对带正电荷的底物分子具有一定的牵引作用[33]。1.1.5L-赖氨酸脱羧酶的催化机理PLP吡哆环上的亚胺基与K367位残基上的ε-氨基共价结合形成希夫碱，即内部醛亚胺；底物分子L-赖氨酸的Cα上的氨基取代K367位的ε-氨基以形成辅酶底物亚胺复合体，即外部醛亚胺[36]。在反应中，辅酶充当电子吸收器，储存来自底物键断裂时的电
本文编号：3124336
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：176 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
L-赖氨酸脱羧酶反应示意图
广西大学博士学位论文用于生物合成戊二胺的新的L-赖氨酸脱羧酶基因的功能鉴定和突变研究2中cadA基因编码酸诱导型L-赖氨酸脱羧酶CadA，cadB基因编码戊二胺转运蛋白CadB，可将CadA蛋白分泌至胞外，cadC基因编码的CadC属于调控蛋白[12,13]。当细胞处于低pH和L-赖氨酸浓度较高的时候，cadC基因被激活，表达产物作用于Pcad，开始合成CadA和CadB蛋白[14,15]。有研究表明在cadC基因上游发现的lysP基因编码的赖氨酸渗透酶LysP对CadC的活性有抑制作用[16]。此外，当细胞内戊二胺的含量较高时可以与CadC结合，抑制其活性，降低cadBA操纵子的转录水平；还可以使细胞膜孔蛋白关闭，影响细胞生长[17,18]。图1-2大肠杆菌中CadBA操纵子的调控模型[11]Fig.1-2TheregulationmodelofCadoperoninE.coli.目前，来源于大肠杆菌（Escherichiacoli）中的L-赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC的酶学特性研究的较为清楚。其中，LdcC在较宽泛的pH值范围内有活性，最适pH值为7.6，而CadA的最适pH值为5.5；LdcC和CadA在温度为52°C条件下活性最高，从热稳定性方面来说，LdcC的热稳定性相对较好；在底物亲和力上，LdcC与CadA对底物的亲和力相当[19]。有文献报道，来源于肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）中的L-赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC的最适作用温度为37°C，最适作用pH为7.0，和大肠杆菌来源的L-赖
广西大学博士学位论文用于生物合成戊二胺的新的L-赖氨酸脱羧酶基因的功能鉴定和突变研究4图1-3L-赖氨酸脱羧酶的二聚体结构[33]Fig.1-3ThestructureofL-lysinedecarboxylasedimer.L-赖氨酸脱羧酶单体结构可以分为五个部分：Wing结构（红色）、Linker结构（橘色）、PLP-SD结构（黄色）、SD4结构（绿色）以及CTD结构（蓝色）[33]。单体结构不具有催化活性，只有当两个单体结合成二聚体时才形成完整的活性中心，即活性中心位于两个单体结合时的接触面。辅因子PLP上的磷酸基团可以与二聚体中的单体1上的T220、S221、S364、H366残基之间形成氢键作用，与单体2上的T398、T399以及S400残基之间形成氢键作用。PLP吡哆环上的N1可以与D330残基侧链的羧基之间形成盐键[34]。His245的咪唑基团与PLP吡哆环的re面平行，有助于催化过程中醌型中间体的形成[35]。L-赖氨酸脱羧酶的二聚体可以作为一个结构单元，通过5个结构单元结合形成十聚合体结构，十聚合体结构中有10个活性中心，可以同时发生催化反应。底物分子进入酶活性中心的通道推测是由CTD结构组成，该通道中含有大量带负电荷的Glu残基，推测其可能对带正电荷的底物分子具有一定的牵引作用[33]。1.1.5L-赖氨酸脱羧酶的催化机理PLP吡哆环上的亚胺基与K367位残基上的ε-氨基共价结合形成希夫碱，即内部醛亚胺；底物分子L-赖氨酸的Cα上的氨基取代K367位的ε-氨基以形成辅酶底物亚胺复合体，即外部醛亚胺[36]。在反应中，辅酶充当电子吸收器，储存来自底物键断裂时的电
本文编号：3124336
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