四川省猪戊型肝炎病毒分子流行病学调查及基因Ⅳ型HEV感染大鼠模型的研究
发布时间：2021-04-19 03:03
戊型肝炎已经成为全球重要的公共卫生问题,戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）是戊型肝炎（Hepatitis E,HE）的病原体。我国是HE的高发地区,1986年-1988年,在我国新疆曾发生HE的大暴发,共发病119280例,罹患率2.96%。国家法定传染病报告结果显示,近年来,中国HE病例数呈持续上升趋势。本研究建立了一种用于检测HEV的巢式RT-PCR方法,对四川省大部分地区HEV感染情况进行调查。在此基础上,通过克隆分析HEV ORF2部分区域,分析其遗传进化情况,为确定我国HEV标准株的研究打下基础。另外,对已建立的HEV感染大鼠模型进行组织嗜性,抗体水平,转氨酶水平及组织病理情况等方面的观察,根据观察结果分析大鼠模型的感染过程,为HEV致病机制的研究打下基础。本研究通过比对国内外20株戊型肝炎病毒的序列,针对戊型肝炎多种基因型的ORF2基因部分保守区域设计内、外两对,扩增片段大小为638bp的巢式PCR引物,对其退火温度进行优化,建立了HEV巢式RT-PCR检测方法,对得到的片段进行克隆并测序。结果显示,用该方法对猪戊型肝炎阳性病料进行检测,目的片段与预...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HEV巢式RT-PCR退火温度的优化
27图1-1HEV巢式RT-PCR退火温度的优化Fig.1-1OptimizationtestofHEVnestedRT-PCRannealingtemperatureM：DL2000DNAMarker；1-7：退火温度依次为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃1-7:Theannealingtemperaturearefrom50℃,51℃,52℃,53℃,54℃,55℃,56℃,respectively3.2阳性质粒pMD19-T-HEV的鉴定将经巢式PCR扩增得到的HEVORF2部分基因片段与Vector（Simple）连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞。用巢式RT-PCR对阳性质粒和空载进行鉴定，结果显示阳性质粒目的片段大小与预期一致，说明该片段已成功克隆到了pMD19-T载体上（图1-2）。图1-2阳性质粒的鉴定Fig.1-2Identificationofpositiveplasmids
28M:DL2000DNAMarker;1-3:pMD19-T-HEV;4:阴性对照M:DL2000DNAMarker;1-3:pMD19-T-HEV;4:Negativecontrol3.3敏感性试验结果核酸蛋白仪测得质粒浓度为135ng/μL，用已巢式RT-PCR方法对已知浓度的质粒进行检测，结果显示巢式RT-PCR可检测到的病毒浓度范围为1.35ng/μL~13.5fg/μL，灵敏度可以达到13.5fg/μL(图1-3)。结果证明，该方法的敏感性较高。图1-3HEV巢式RT-PCR的敏感性试验Fig.1-3SensitivitytestofnestedRT-PCRfordetectionofHEVM：DL2000DNAMarker；1：阳性对照；2-8：样品浓度依次为1.35ng/μL，135pg/μL，13.5pg/μL，1.35pg/μL，135fg/μL，13.5fg/μL，1.35fg/μL；9：阴性对照M:DL2000DNAMarker;1:positivecontrol;2-8:Thesampleconcentrationarefrom1.35ng/μL，135pg/μL，13.5pg/μL，1.35pg/μL，135fg/μL，13.5fg/μL，1.35fg/μL,respectively;9:Negativecontrol3.4特异性试验结果用已建立的巢式RT-PCR方法对ProVA、CSFV、TGEV、PEDV、PRRSV和HEV阳性质粒进行检测，结果显示只有HEV阳性质粒能够扩增出条带（图1-4），证明所建立的方法具有很强的特异性。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪戊型肝炎病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 李幽幽,龚双燕,李小璟,毛汐语,邓益超,朱玲,徐志文. 中国人兽共患病学报. 2017(11)
[2]中国地区动物戊型肝炎病毒基因型的地理分布[J]. 刘敏,李丽娟,肖文. 承德医学院学报. 2017(01)
[3]戊型肝炎病毒感染模型研究进展[J]. 李文贵,段新慧,张佳,严红亚. 动物医学进展. 2014(06)
[4]实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J]. 陈旭,齐凤坤,康立功,李景富. 东北农业大学学报. 2010(08)
[5]实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展[J]. 尹兵. 科技信息. 2010(17)
[6]实验感染戊型肝炎病毒动物模型的研究进展[J]. 耿家宝,王玲,朱永红,庄辉. 中国预防医学杂志. 2010(04)
[7]实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用[J]. 刘小荣,张笠,王勇平. 中国组织工程研究与临床康复. 2010(02)
[8]四型戊肝病毒的比较研究[J]. 赵慧,张文,华修国. 上海交通大学学报(农业科学版). 2009(02)
[9]戊型肝炎病毒Ⅳ型中国恒河猴动物模型的建立[J]. 杨志国,许家璋,鞠九龙,许远红,邱红,乐美兆,孟继鸿. 江苏医药. 2006(02)
[10]我国戊型肝炎研究[J]. 庄辉,毕胜利,王佑春,李凡,朱万孚,朱永红,李奎. 北京大学学报(医学版). 2002(05)
博士论文
[1]新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究[D]. 武军元.华中农业大学 2017
[2]猪戊型肝炎病毒分子流行病学分析及基因3型猪戊型肝炎病毒感染性克隆的构建[D]. 司伏生.南京农业大学 2011
[3]猪戊型肝炎病毒V1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 李丹丹.东北农业大学 2008
硕士论文
[1]猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及盐城地区流行病学调查[D]. 闫蕾.黑龙江八一农垦大学 2016
[2]石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究[D]. 夏小伟.石河子大学 2015
[3]苏中地区猪戊型肝炎病毒的检测及ORF2融合蛋白对SD大鼠的免疫保护性实验[D]. 郭志.扬州大学 2014
[4]中国猪戊型肝炎（HE）的分布及HEV ORF2片段的基因克隆与原核表达载体的构建[D]. 伏丽萍.山东农业大学 2004
本文编号：3146698
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
HEV巢式RT-PCR退火温度的优化
27图1-1HEV巢式RT-PCR退火温度的优化Fig.1-1OptimizationtestofHEVnestedRT-PCRannealingtemperatureM：DL2000DNAMarker；1-7：退火温度依次为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃1-7:Theannealingtemperaturearefrom50℃,51℃,52℃,53℃,54℃,55℃,56℃,respectively3.2阳性质粒pMD19-T-HEV的鉴定将经巢式PCR扩增得到的HEVORF2部分基因片段与Vector（Simple）连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞。用巢式RT-PCR对阳性质粒和空载进行鉴定，结果显示阳性质粒目的片段大小与预期一致，说明该片段已成功克隆到了pMD19-T载体上（图1-2）。图1-2阳性质粒的鉴定Fig.1-2Identificationofpositiveplasmids
28M:DL2000DNAMarker;1-3:pMD19-T-HEV;4:阴性对照M:DL2000DNAMarker;1-3:pMD19-T-HEV;4:Negativecontrol3.3敏感性试验结果核酸蛋白仪测得质粒浓度为135ng/μL，用已巢式RT-PCR方法对已知浓度的质粒进行检测，结果显示巢式RT-PCR可检测到的病毒浓度范围为1.35ng/μL~13.5fg/μL，灵敏度可以达到13.5fg/μL(图1-3)。结果证明，该方法的敏感性较高。图1-3HEV巢式RT-PCR的敏感性试验Fig.1-3SensitivitytestofnestedRT-PCRfordetectionofHEVM：DL2000DNAMarker；1：阳性对照；2-8：样品浓度依次为1.35ng/μL，135pg/μL，13.5pg/μL，1.35pg/μL，135fg/μL，13.5fg/μL，1.35fg/μL；9：阴性对照M:DL2000DNAMarker;1:positivecontrol;2-8:Thesampleconcentrationarefrom1.35ng/μL，135pg/μL，13.5pg/μL，1.35pg/μL，135fg/μL，13.5fg/μL，1.35fg/μL,respectively;9:Negativecontrol3.4特异性试验结果用已建立的巢式RT-PCR方法对ProVA、CSFV、TGEV、PEDV、PRRSV和HEV阳性质粒进行检测，结果显示只有HEV阳性质粒能够扩增出条带（图1-4），证明所建立的方法具有很强的特异性。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪戊型肝炎病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 李幽幽,龚双燕,李小璟,毛汐语,邓益超,朱玲,徐志文. 中国人兽共患病学报. 2017(11)
[2]中国地区动物戊型肝炎病毒基因型的地理分布[J]. 刘敏,李丽娟,肖文. 承德医学院学报. 2017(01)
[3]戊型肝炎病毒感染模型研究进展[J]. 李文贵,段新慧,张佳,严红亚. 动物医学进展. 2014(06)
[4]实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J]. 陈旭,齐凤坤,康立功,李景富. 东北农业大学学报. 2010(08)
[5]实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展[J]. 尹兵. 科技信息. 2010(17)
[6]实验感染戊型肝炎病毒动物模型的研究进展[J]. 耿家宝,王玲,朱永红,庄辉. 中国预防医学杂志. 2010(04)
[7]实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用[J]. 刘小荣,张笠,王勇平. 中国组织工程研究与临床康复. 2010(02)
[8]四型戊肝病毒的比较研究[J]. 赵慧,张文,华修国. 上海交通大学学报(农业科学版). 2009(02)
[9]戊型肝炎病毒Ⅳ型中国恒河猴动物模型的建立[J]. 杨志国,许家璋,鞠九龙,许远红,邱红,乐美兆,孟继鸿. 江苏医药. 2006(02)
[10]我国戊型肝炎研究[J]. 庄辉,毕胜利,王佑春,李凡,朱万孚,朱永红,李奎. 北京大学学报(医学版). 2002(05)
博士论文
[1]新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究[D]. 武军元.华中农业大学 2017
[2]猪戊型肝炎病毒分子流行病学分析及基因3型猪戊型肝炎病毒感染性克隆的构建[D]. 司伏生.南京农业大学 2011
[3]猪戊型肝炎病毒V1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 李丹丹.东北农业大学 2008
硕士论文
[1]猪戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立及盐城地区流行病学调查[D]. 闫蕾.黑龙江八一农垦大学 2016
[2]石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究[D]. 夏小伟.石河子大学 2015
[3]苏中地区猪戊型肝炎病毒的检测及ORF2融合蛋白对SD大鼠的免疫保护性实验[D]. 郭志.扬州大学 2014
[4]中国猪戊型肝炎（HE）的分布及HEV ORF2片段的基因克隆与原核表达载体的构建[D]. 伏丽萍.山东农业大学 2004
本文编号：3146698
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