中华薄壳介几丁质酶基因工程抗原制备及抗体的适用性研究

发布时间：2021-04-23 10:20

　　几丁质酶作为生物指示物,常常用于农药水生生态风险评估,尤其是用于评估农药对甲壳类动物种群发育的影响。介形虫是浮游动物的重要组成部分,尤其是底栖节肢动物中最常见的物种。介形虫的种群丰度,在一定程度上,往往能够揭示出某一水域的健康状况。已有研究表明,水域中几丁质酶的含量与浮游节肢动物的种群丰度具有相关性。为了高效、便捷、专一的测量水域中介形虫几丁质酶含量,我们需要开发出能特异性识别介形虫几丁质酶的抗体。本文首先利用RT-PCR技术和RACE技术,从中华薄壳介体内克隆获得几丁质酶（Chitinase）基因的cDNA和gDNA全长序列。结果显示,中华薄壳介几丁质酶基因（DsChi）由10个外显子和9个内含子构成,开放阅读框为1821bp,编码606个氨基酸。再通过双酶切技术,将目的基因与表达载体（pET-30a（+））连接,成功构建出重组表达载体。重组表达载体转化大肠杆菌后,阳性菌株经IPTG诱导培养,表达得到了重组几丁质酶蛋白。以纯化的重组几丁质酶蛋白为免疫原,免疫新西兰白兔,成功制备了兔抗中华薄壳介重组几丁质酶抗血清,经过纯化得到了抗体球蛋白,经ELISA检测,抗体对重组几丁质酶蛋白的效价... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
术语与缩略语列表
第一章 研究综述
    1.1 本文研究背景
    1.2 几丁质酶研究进展
        1.2.1 几丁质
        1.2.2 几丁质的水解
        1.2.3 几丁质酶的研究概况
    1.3 介形虫研究进展
    1.4 几丁质酶的分子克隆
    1.5 抗原的制备
    1.6 抗体的制备
    1.7 酶联免疫吸附测定（ELISA）
    1.8 本文主要研究内容
第二章 中华薄壳介几丁质酶的克隆
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 中间片段的基因克隆
        2.2.3 全长序列的RACE扩增
        2.2.4 中华薄壳介gDNA的扩增
        2.2.5 序列分析和系统进化树的构建
    2.3 结果与分析
        2.3.1 总RNA的提取
        2.3.2 目的基因序列的获得
        2.3.3 基因结构
        2.3.4 氨基酸结构分析
        2.3.5 多重序列比对分析
        2.3.6 进化树构建
    2.4 讨论
第三章 中华薄壳介几丁质酶基因的表达与纯化
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验试剂
        3.2.2 实验仪器与设备
        3.2.3 实验方法
    3.3 结果与分析
        3.3.1 重组质粒鉴定结果
        3.3.2 表达结果鉴定
        3.3.3 上清中亲和层析纯化几丁质酶蛋白鉴定结果
        3.3.4 包涵体通过亲和层析纯化几丁质酶蛋白
        3.3.5 蛋白浓度鉴定
        3.3.6 蛋白WB检测
    3.4 讨论
第四章 介形虫重组几丁质酶多克隆抗体的制备
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验方法
    4.3 结果与分析
        4.3.1 抗体制备结果检测
        4.3.2 确定最适抗原抗体工作浓度
        4.3.3 标准曲线
    4.4 讨论
第五章 中华薄壳介几丁质酶多克隆抗体抗体特异性研究
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 实验方法
    5.3 结果与分析
    5.4 讨论
第六章 总结与展望
    6.1 总结
    6.2 主要创新点
    6.3 不足与展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]有机磷农药广谱特异性单克隆抗体的制备及特性分析[J]. 李盼,张晓帅,邱雨楼,闫莉婷,杨茜茹,刘贤金,张存政,许扬.  江苏农业学报. 2017(06)
[2]三疣梭子蟹多克隆抗体与4种经济蟹类血细胞交叉反应的研究[J]. 蔡鑫,邓灯,王颖,王文琪.  水产科学. 2017(03)
[3]水生甲壳类几丁质酶类基因家族功能与表达调控的研究进展[J]. 李旭光,周刚,周军,林海,李跃华,陆全平,付龙龙,张云贵.  水产养殖. 2017(04)
[4]水环境中水生态监测的研究进展[J]. 薛艳.  环境与可持续发展. 2016(06)
[5]大型溞ChE和NAGase间接竞争和非竞争ELISA方法的比较[J]. 郎倩萍,李少南,郑佳豪,张文萍.  安徽农业科学. 2016(24)
[6]重金属铬单克隆抗体特异性ELISA免疫检测方法的建立[J]. 俞华齐,王娟,姜忍忍,姚刚,刘少伟.  江苏农业学报. 2016(02)
[7]应用基于单克隆抗体的免疫传感器检测环境中的芘和苯并芘[J]. 李鑫,乔琰,钟国祯.  环境科学. 2015(11)
[8]三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析[J]. 王伟,吴旭干,潘桂平,侯文杰,成永旭.  水产学报. 2015(09)
[9]利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶含量评价农药对花翅摇蚊种群发育的影响[J]. 周素锐,张文萍,李少南,朱国念.  生态毒理学报. 2015(01)
[10]水生甲壳类蜕皮发生过程及其影响因素的研究与进展[J]. 李旭光,周刚,谷孝鸿.  动物学杂志. 2014(02)



本文编号：3155149