木麻黄愈伤组织再生体系的构建和转基因研究
发布时间：2021-04-23 08:28
木麻黄（Casuarina）是优良的沿海防护林树种。其中Casuarina equisetifolia（属于短枝木麻黄的一种）的基因组最近测序完成,使得木麻黄具有了成为耐盐模式树种的潜力,也亟需开发其转基因体系为分子研究服务。然而现有的转基因体系仅限于轮生木麻黄、细枝木麻黄、粗枝木麻黄,且其方法均不适用于Casuarina equisetifolia。本研究使用测序木麻黄（Casuarina equisetifolia）的幼嫩枝条为研究材料,建立了快速、高效的愈伤组织再生体系,并在此基础上初步确立了农杆菌介导的木麻黄遗传转化条件。同时,我们对CRISPR/Cas9系统sgRNA序列单碱基错配进行了分析,为将来敲除测序木麻黄基因时sgRNA的设计提供了理论依据。主要研究结果如下:1、木麻黄幼嫩枝条愈伤组织再生体系:（1）两步法暗培养诱导愈伤组织,首先在1/2MS基础培养基中添加0.1 mg·L-1NAA和0.1 mg·L-1 TDZ诱导愈伤组织产生,愈伤组织诱导率为99.33%;再在1/2MS基础培养基中添加0.5 mg·L-1
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
1.1 研究背景
1.1.1 木麻黄简述
1.1.2 林木的转基因研究概况
1.1.3 木麻黄基因工程研究
1.1.3.1 木麻黄无性繁殖再生研究
1.1.3.2 木麻黄转基因研究
1.1.4 植物转基因技术概述
1.1.4.1 基因枪技术
1.1.4.2 农杆菌转化技术
1.2 目的和意义
1.3 主要研究内容
1.3.1 构建木麻黄愈伤组织再生体系
1.3.2 构建木麻黄遗传转化体系
1.3.3 木麻黄转基因植株的鉴定
1.3.4 木麻黄內源耐盐基因的遗传转化
1.4 技术路线
第二章 建立愈伤组织再生体系
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 植物材料
2.1.1.2 培养基、试剂和仪器
2.1.2 方法
2.1.2.1 外植体的获取与处理
2.1.2.2 愈伤组织、不定芽及不定根诱导培养
2.1.2.3 不定芽的生根培养
2.1.2.4 再生苗的移栽、驯化
2.1.2.5 试验现象的观察记录及数据的收集处理
2.2 结果分析
2.2.1 愈伤组织的诱导与增殖
2.2.2 不定芽的诱导
2.2.3 不定芽生根
2.3 讨论
2.3.1 诱导愈伤组织的不同外植体的优缺点
2.3.2 两种不同基础培养基对再生体系的影响
2.3.3 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
2.4 小结
第三章 木麻黄农杆菌遗传转化体系的初步建立
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.1.1 受体材料
3.1.1.2 菌株和质粒
3.1.1.3 培养基
3.1.1.4 试剂和仪器
3.1.2 方法
3.1.2.1 As和抗生素的配制和使用
3.1.2.2 农杆菌C58C1和GV3101感受态的制备与
3.1.2.3 目的质粒转化农杆菌C58C1和GV
3.1.2.4 农杆菌侵染液的制备（无菌操作）
3.1.2.5 农杆菌遗传转化的基本步骤
3.1.2.6 抗生素敏感性试验
3.1.2.7 木麻黄遗传转化效率影响因素试验设计
3.1.2.8 gus基因化学组织染色
3.1.3 试验现象的观察记录及数据的收集处理
3.2 结果分析
3.2.1 工程菌株与共培养时间的选择
3.2.2 Car对农杆菌的生长抑制性
3.2.3 Hyg筛选体系中培养条件的研究
3.2.3.1 受体材料对潮霉素的耐受性
3.2.3.2 Hyg筛选过程中As的使用
3.2.4 Kan筛选体系中培养条件的研究
3.2.4.1 受体材料对Kan的耐受性
3.2.4.2 Kan筛选体系中As的使用
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 转基因表达载体的构建
4.1 木麻黄CeNCS2基因过表达载体构建
4.1.1 材料和试剂
4.1.1.1 植物材料
4.1.1.2 试剂和仪器
4.1.1.3 菌株和载体
4.1.2 试验方法
4.1.2.1 木麻黄总RNA提取
4.1.2.2 木麻黄cDNA合成
4.1.2.3 CeNCS2基因克隆
4.1.2.4 目的基因体外扩增
4.1.2.5 大肠杆菌DH5α感受态制备
4.1.2.6 外源片段连接和大肠杆菌转化
4.1.2.7 阳性克隆筛选、菌检、测序及质粒提取
4.1.2.8 双酶切反应
4.2 木麻黄CeNCS2基因过表达载体构建结果
4.2.1 木麻黄总RNA质量检测
4.2.2 CeNCS2基因克隆（PCR和测序结果）
4.2.3 双酶切载体构建（PCR和测序结果）
4.3 木麻黄CeSnRK2基因家族敲除载体构建
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 方法
4.4 木麻黄CeSnRK2基因家族敲除载体构建结果
4.5 小结与讨论
第五章 CRISPR/CAS9系统SGRNA序列单碱基错配研究
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.2 结果分析
5.2.1 水稻MIR156a、MIR156b和MIR156c的基因编辑
5.2.2 水稻DST的基因编辑
5.3 讨论与小结
第六章 总结和展望
6.1 结论
6.1.1 木麻黄愈伤组织再生体系
6.1.2 木麻黄遗传转化体系
6.1.3 木麻黄基因表达载体的构建
6.1.4 CRISPR/Cas9系统sgRNA序列单碱基错配研究
6.2 讨论
6.3 展望
参考文献
附录1
附录2
附录3 缩写词表
个人简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]浙江省海岸线分类保护和围填海分类管理[J]. 陈甫源,王琪,曾剑,韩宇. 海洋开发与管理. 2018(06)
[2]低温胁迫下短枝木麻黄耐寒相关基因的差异表达分析[J]. 李楠,郑勇奇,丁红梅,柳新红,盛炜彤,江波,李海波. 林业科学. 2017(07)
[3]木麻黄无性系苗期耐寒性研究[J]. 何贵平,陈雨春,陈炳,谭君琴,袁杰,王涛. 江西农业大学学报. 2015(03)
[4]细枝木麻黄离体培养过程中愈伤组织和再生芽的细胞组织学观察[J]. 姜清彬,仲崇禄,陈羽,刘芬,张勇,陈珍. 热带亚热带植物学报. 2015(01)
[5]粗枝木麻黄在海南的种源试验与早期选择[J]. 马妮,张勇,仲崇禄,姜清彬,陈羽,陈珍,胡盼,王仁开. 林业科学研究. 2014(03)
[6]细枝木麻黄组织培养和转基因研究[J]. 林永生,蒋晶,乔桂荣,李海营,邱文敏,卓仁英. 安徽农业科学. 2012(03)
[7]木麻黄共生固氮菌Frankia的分离鉴定及固氮效应[J]. 张昕,马新颖,王秋芹,陈友吾,林海萍,马良进. 生态学杂志. 2011(09)
[8]低温处理对耐寒粗枝木麻黄无性系生理指标的影响[J]. 何贵平,卓仁英,陈雨春,黄一青,彭柳青. 林业科学研究. 2011(04)
[9]抗生素对细枝木麻黄愈伤组织再生及农杆菌生长的影响[J]. 姜清彬,仲崇禄,曾炳山,张勇,Didier Bogusz,Claudine Franche. 东北林业大学学报. 2010(09)
[10]发根农杆菌Ri质粒T-DNA对杜仲的遗传转化研究[J]. 王跃华,孙雁霞,吴洁,阎文昭,徐作英,张海强. 西南农业学报. 2008(01)
博士论文
[1]细枝木麻黄再生体系及农杆菌介导遗传转化研究[D]. 姜清彬.中国林业科学研究院 2011
[2]樟树体细胞胚再生体系的优化和转化Barnase、PaFT基因的研究[D]. 施雪萍.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]枇杷高频率体胚发生体系的建立及其遗传转化初步研究[D]. 沈庆斌.福建农林大学 2005
本文编号：3154993
【文章来源】：浙江农林大学浙江省
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
1.1 研究背景
1.1.1 木麻黄简述
1.1.2 林木的转基因研究概况
1.1.3 木麻黄基因工程研究
1.1.3.1 木麻黄无性繁殖再生研究
1.1.3.2 木麻黄转基因研究
1.1.4 植物转基因技术概述
1.1.4.1 基因枪技术
1.1.4.2 农杆菌转化技术
1.2 目的和意义
1.3 主要研究内容
1.3.1 构建木麻黄愈伤组织再生体系
1.3.2 构建木麻黄遗传转化体系
1.3.3 木麻黄转基因植株的鉴定
1.3.4 木麻黄內源耐盐基因的遗传转化
1.4 技术路线
第二章 建立愈伤组织再生体系
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 植物材料
2.1.1.2 培养基、试剂和仪器
2.1.2 方法
2.1.2.1 外植体的获取与处理
2.1.2.2 愈伤组织、不定芽及不定根诱导培养
2.1.2.3 不定芽的生根培养
2.1.2.4 再生苗的移栽、驯化
2.1.2.5 试验现象的观察记录及数据的收集处理
2.2 结果分析
2.2.1 愈伤组织的诱导与增殖
2.2.2 不定芽的诱导
2.2.3 不定芽生根
2.3 讨论
2.3.1 诱导愈伤组织的不同外植体的优缺点
2.3.2 两种不同基础培养基对再生体系的影响
2.3.3 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
2.4 小结
第三章 木麻黄农杆菌遗传转化体系的初步建立
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.1.1 受体材料
3.1.1.2 菌株和质粒
3.1.1.3 培养基
3.1.1.4 试剂和仪器
3.1.2 方法
3.1.2.1 As和抗生素的配制和使用
3.1.2.2 农杆菌C58C1和GV3101感受态的制备与
3.1.2.3 目的质粒转化农杆菌C58C1和GV
3.1.2.4 农杆菌侵染液的制备（无菌操作）
3.1.2.5 农杆菌遗传转化的基本步骤
3.1.2.6 抗生素敏感性试验
3.1.2.7 木麻黄遗传转化效率影响因素试验设计
3.1.2.8 gus基因化学组织染色
3.1.3 试验现象的观察记录及数据的收集处理
3.2 结果分析
3.2.1 工程菌株与共培养时间的选择
3.2.2 Car对农杆菌的生长抑制性
3.2.3 Hyg筛选体系中培养条件的研究
3.2.3.1 受体材料对潮霉素的耐受性
3.2.3.2 Hyg筛选过程中As的使用
3.2.4 Kan筛选体系中培养条件的研究
3.2.4.1 受体材料对Kan的耐受性
3.2.4.2 Kan筛选体系中As的使用
3.3 讨论
3.4 小结
第四章 转基因表达载体的构建
4.1 木麻黄CeNCS2基因过表达载体构建
4.1.1 材料和试剂
4.1.1.1 植物材料
4.1.1.2 试剂和仪器
4.1.1.3 菌株和载体
4.1.2 试验方法
4.1.2.1 木麻黄总RNA提取
4.1.2.2 木麻黄cDNA合成
4.1.2.3 CeNCS2基因克隆
4.1.2.4 目的基因体外扩增
4.1.2.5 大肠杆菌DH5α感受态制备
4.1.2.6 外源片段连接和大肠杆菌转化
4.1.2.7 阳性克隆筛选、菌检、测序及质粒提取
4.1.2.8 双酶切反应
4.2 木麻黄CeNCS2基因过表达载体构建结果
4.2.1 木麻黄总RNA质量检测
4.2.2 CeNCS2基因克隆（PCR和测序结果）
4.2.3 双酶切载体构建（PCR和测序结果）
4.3 木麻黄CeSnRK2基因家族敲除载体构建
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 方法
4.4 木麻黄CeSnRK2基因家族敲除载体构建结果
4.5 小结与讨论
第五章 CRISPR/CAS9系统SGRNA序列单碱基错配研究
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 方法
5.2 结果分析
5.2.1 水稻MIR156a、MIR156b和MIR156c的基因编辑
5.2.2 水稻DST的基因编辑
5.3 讨论与小结
第六章 总结和展望
6.1 结论
6.1.1 木麻黄愈伤组织再生体系
6.1.2 木麻黄遗传转化体系
6.1.3 木麻黄基因表达载体的构建
6.1.4 CRISPR/Cas9系统sgRNA序列单碱基错配研究
6.2 讨论
6.3 展望
参考文献
附录1
附录2
附录3 缩写词表
个人简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]浙江省海岸线分类保护和围填海分类管理[J]. 陈甫源,王琪,曾剑,韩宇. 海洋开发与管理. 2018(06)
[2]低温胁迫下短枝木麻黄耐寒相关基因的差异表达分析[J]. 李楠,郑勇奇,丁红梅,柳新红,盛炜彤,江波,李海波. 林业科学. 2017(07)
[3]木麻黄无性系苗期耐寒性研究[J]. 何贵平,陈雨春,陈炳,谭君琴,袁杰,王涛. 江西农业大学学报. 2015(03)
[4]细枝木麻黄离体培养过程中愈伤组织和再生芽的细胞组织学观察[J]. 姜清彬,仲崇禄,陈羽,刘芬,张勇,陈珍. 热带亚热带植物学报. 2015(01)
[5]粗枝木麻黄在海南的种源试验与早期选择[J]. 马妮,张勇,仲崇禄,姜清彬,陈羽,陈珍,胡盼,王仁开. 林业科学研究. 2014(03)
[6]细枝木麻黄组织培养和转基因研究[J]. 林永生,蒋晶,乔桂荣,李海营,邱文敏,卓仁英. 安徽农业科学. 2012(03)
[7]木麻黄共生固氮菌Frankia的分离鉴定及固氮效应[J]. 张昕,马新颖,王秋芹,陈友吾,林海萍,马良进. 生态学杂志. 2011(09)
[8]低温处理对耐寒粗枝木麻黄无性系生理指标的影响[J]. 何贵平,卓仁英,陈雨春,黄一青,彭柳青. 林业科学研究. 2011(04)
[9]抗生素对细枝木麻黄愈伤组织再生及农杆菌生长的影响[J]. 姜清彬,仲崇禄,曾炳山,张勇,Didier Bogusz,Claudine Franche. 东北林业大学学报. 2010(09)
[10]发根农杆菌Ri质粒T-DNA对杜仲的遗传转化研究[J]. 王跃华,孙雁霞,吴洁,阎文昭,徐作英,张海强. 西南农业学报. 2008(01)
博士论文
[1]细枝木麻黄再生体系及农杆菌介导遗传转化研究[D]. 姜清彬.中国林业科学研究院 2011
[2]樟树体细胞胚再生体系的优化和转化Barnase、PaFT基因的研究[D]. 施雪萍.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]枇杷高频率体胚发生体系的建立及其遗传转化初步研究[D]. 沈庆斌.福建农林大学 2005
本文编号：3154993
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