靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建与鉴定

发布时间：2021-04-23 22:37

　　目的:构建靶向低氧诱导因子（HIF）-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并体外鉴定其敲除效果。方法:设计靶向HIF-1α基因的gRNA序列,将其插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体p CAG-T7中,转化后挑取克隆,进行测序验证。将构建好的重组质粒体外转染人肝癌细胞Hep G2和SK-Hep-1,利用嘌呤霉素进行筛选并扩大培养获得HIF-1α基因敲除混合克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和混合克隆细胞中HIF-1α蛋白的表达情况。结果:经测序验证,成功构建了靶向HIF-1α的重组质粒p CAG-T7-HIF-1α-gRNA,经Western blot验证,转染该重组质粒后人肝癌细胞株Hep G2和SK-Hep-1经Co Cl2诱导HIF-1α蛋白表达明显减弱。结论:成功构建了靶向HIF-1α基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒载体。 

【文章来源】：郑州大学学报(医学版). 2016,51(03)北大核心

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 主要试剂
    1.2 靶向HIF-1α基因的gRNA的设计和合成
    1.3 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA载体的构建及鉴定
    1.4 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA对肝癌细胞的转染
    1.5 细胞中HIF-1α蛋白的Western blot法检测
2 结果
    2.1 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA的鉴定
    2.2 p CAG-T7-HIF-1α-gRNA对Hep G2、SK-Hep-1细胞的转染效果
    2.3 基因敲除效果
3 讨论



本文编号：3156170