利用CRISPR/Cas9全基因组文库筛选HCT 116细胞增殖和辐射相关基因

发布时间：2021-04-27 03:15

　　目的:基因编辑技术的不断发展为基因功能和基因治疗等研究提供了强大的技术支持。CRISPR/Cas9作为新兴的基因编辑技术,具有更高效的编辑能力。2013年张锋课题组首次使用CRISPR/Cas9技术在哺乳动物细胞中进行基因改造,利用sgRNA文库实现对多个基因的敲除,极大的提高了基因编辑效率,同时降低了脱靶效应。目前大规模CRISPR/Cas9文库筛选被应用到多个领域,可进行筛选药靶基因、耐药基因及肿瘤增殖基因等。本研究一方面通过在HCT 116细胞内大规模感染GeCKO慢病毒文库,在全基因组范围筛选与HCT 116细胞增殖相关的基因。另一方面,通过在HCT 116细胞内大规模感染GeCKO慢病毒文库后,对细胞进行辐射损伤处理,以筛选出与细胞抗辐射相关的基因。方法:HCT 116细胞增殖相关基因筛选:1)将HCT 116细胞培养至约3 10⁸个,使用GeCKO慢病毒文库进行大规模感染;感染1天后,更换为含有2 g/l嘌呤霉素的完全培养基继续培养6天,收取部分细胞作为6天样品组,剩余细胞继续培养至16天,并收取细胞。2)提取各组样品基因组DNA,采用巢式PCR法扩增... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
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第一章 利用CRISPR/Cas9 全基因组文库筛选HCT116 细胞增殖相关基因
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 细胞系
            2.1.2 主要试剂与材料
            2.1.3 主要仪器
            2.1.4 主要溶液的配制
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 GeCKO文库大规模感染细胞
            2.2.3 细胞基因组DNA提取
            2.2.4 巢式PCR扩增sgRNA序列
            2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
            2.2.6 琼脂糖凝胶DNA回收
            2.2.7 T载体连接
            2.2.8 Illumina测序平台高通量测序与生物信息学分析
            2.2.9 miRNA靶基因预测
    3 结果
        3.1 基因组插入sg RNA序列验证
        3.2 基因组插入sg RNA大规模测序及分析
        3.3 增殖相关阴性筛选基因GO富集分析
        3.4 增殖相关阳性筛选基因GO富集分析
        3.5 增殖相关mi RNA靶基因网络分析
    4 讨论
    5 小结
第二章 利用CRISPR/Cas9 全基因组文库筛选HCT116 细胞辐射相关基因
    1 前言
    2.材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 细胞系
            2.1.2 主要试剂与材料
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞培养
            2.2.2 GeCKO文库大规模感染细胞
            2.2.3 细胞辐射处理
            2.2.4 细胞基因组DNA提取
            2.2.5 Illumina测序平台高通量测序
            2.2.6 生物信息学分析
            2.2.7 细胞内干涉RPL12、MESP1 基因
            2.2.8 qPCR检测基因表达水平
            2.2.9 CCK8 法检测细胞增殖
    3 结果
        3.1 测序数据产出与质量统计
        3.2 数据比对与Screen Read count分析
        3.3 gRNA和基因计数
        3.4 丢失gRNA与丢失基因数目统计
        3.5 样本聚类分析
        3.6 MAGeCK软件beta score算法筛选与辐射相关的基因
        3.7 辐射相关阴性筛选基因GO富集分析
        3.8 辐射相关阳性筛选基因GO富集分析
        3.9 辐射相关mi RNA靶基因网络分析
        3.10 辐射相关基因RPL12、MESP1 的初步功能验证
    4 讨论
    5 小结
总结
参考文献
附录1
附录2
致谢
综述
    参考文献



本文编号：3162654