CRISPR/Cas9介导的文心兰Fd和FNR基因编辑研究

发布时间：2021-04-27 03:37

　　文心兰（Oncidium hybridum）是兰科（Orchidaceae）文心兰属植物,具有发展前景的热带花卉。Fd（ferredoxin）和FNR（ferredoxin-NADP⁺oxidoreductase）作为高等植物中广泛存在的电子传递蛋白,广泛参与植物细胞的生理生化过程。植物中存在多种类型的Fd和FNR,不仅提供氧化还原的能量,而且在逆境胁迫下发挥作用。本研究对文心兰中Fd及FNR基因进行克隆及分析,并利用过表达及CRISPR/Cas9技术对FdC2及RFNR基因在文心兰类原球茎（protocorm-like body,PLB）的发育进行研究。主要结果如下:1.文心兰Fd基因的克隆及表达分析以文心兰类原球茎及试管苗的混合样品为材料,根据文心兰转录组数据筛选获得7条Fd基因的序列,克隆获得文心兰中Fd基因家族的成员,它们编码的氨基酸数目均少于200个。基本生物信息学分析表明:文心兰Fd基因家族包括1个线粒体型的MFDX和6个叶绿体型的Fd,它们与蝴蝶兰中的Fd亲缘关系较近;文心兰Fd基因家族在进化过程中,受突变压力、自然选择及其它因素的影响形成了使用A/... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：107 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 文心兰组织培养研究进展
    1.2 植物铁氧还蛋白和铁氧还蛋白氧化还原酶研究进展
    1.3 植物中CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究进展
    1.4 文心兰遗传转化研究进展
    1.5 本研究的意义和主要研究内容
第二章 文心兰Fd基因的克隆及分析
    第一节 文心兰Fd基因的克隆及生物信息学分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 文心兰Fd基因的克隆
            2.2 文心兰Fd基因家族成员的生物信息学分析
        3 讨论
            3.1 文心兰Fd基因的类型
            3.2 文心兰Fd基因的分子特性
    第二节 文心兰Fd基因密码子偏好性分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 文心兰Fd基因有效密码子数和GC含量
            2.2 文心兰Fd基因同义密码子相对使用度
            2.3 基于密码子使用偏好性和氨基酸序列的系统聚类
            2.4 中性绘图分析
            2.5 ENC绘图分析
            2.6 PR2 偏差分析
        3 讨论
            3.1 文心兰Fd基因密码子偏好性分析
            3.2 文心兰Fd基因密码子偏好性影响因素
    第三节 文心兰Fd基因表达分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 文心兰Fd基因不同组织部位及不同发育阶段的表达分析
            2.2 软腐病不同感病时间文心兰Fd基因表达分析
            2.3 高温处理不同时间文心兰Fd基因表达分析
        3 讨论
            3.1 文心兰Fd基因具有组织表达特异性
            3.2 Fd基因均参与文心兰的生长发育及胁迫响应
第三章 文心兰FNR基因的克隆及分析
    第一节 文心兰RFNR基因的克隆及FNR基因生物信息学分析
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 文心兰RFNR基因的克隆
            2.2 文心兰FNR基因生物信息学分析
        3 讨论
            3.1 文心兰RFNR比 LFNR保守性更强
    第二节 兰科植物FNR基因的密码子偏好性分析
        1 材料与方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 兰科植物FNR基因有效密码子数和GC含量
            2.2 兰科植物FNR基因同义密码子相对使用度
            2.3 主要偏好密码子分析
            2.4 不同区域FNR基因密码子偏好性分析
            2.5 基于密码子使用偏好性和CDS序列的系统聚类
            2.6 中性绘图分析
            2.7 ENC绘图分析
            2.8 PR2 偏差分析
        3 讨论
            3.1 兰科植物FNR基因密码子偏好性分析
            3.2 兰科植物FNR基因聚类分析比较
            3.3 兰科植物FNR基因密码子偏好性影响因素
    第三节 文心兰FNR基因表达分析
        1 材料与方法
            1.1 试验材料及处理方法
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 FNR基因在文心兰不同组织部位及不同发育阶段的表达分析
            2.2 FNR基因在文心兰不同胁迫处理下的表达分析
        3 讨论
            3.1 文心兰FNR基因具有组织表达特异性
            3.2 文心兰LFNR基因和RFNR基因在生长发育及胁迫响应中都具有差异性
第四章 文心兰FdC2和RFNR的亚细胞定位及过表达研究
    第一节 文心兰FdC2和RFNR的亚细胞定位观察
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验试剂及仪器
            1.3 FdC2及RFNR的 pCAMBIA1302 载体的构建
            1.4 重组质粒转化农杆菌感受态
            1.5 农杆菌侵染烟草及文心兰叶片
            1.6 亚细胞定位观察
        2 结果与分析
            2.1 酶切位点分析结果
            2.2 目的片段及线性化载体的获得
            2.3 重组载体的建立
            2.4 烟草叶片亚细胞定位结果
            2.5 文心兰叶片亚细胞定位结果
        3 讨论
            3.1 文心兰FdC2 蛋白均定位于叶绿体
            3.2 文心兰LFNR和 RFNR蛋白定位于叶绿体
    第二节 过表达FdC2和RFNR的类原球茎分子检测及形态观察
        1 材料与方法
            1.1 受体材料
            1.2 方法
        2 结果与分析
            2.1 过表达FdC2及RFNR的文心兰类原球茎中标记基因的检测
            2.2 过表达FdC2及RFNR的文心兰类原球茎中FdC2及FNR基因的表达分析
            2.3 软腐病菌处理过表达FdC2及RFNR基因的文心兰类原球茎中Fd C2及RFNR基因的表达分析
            2.4 筛选30 d文心兰类原球茎GFP荧光观察
            2.5 过表达FdC2和RFNR的文心兰的表型观察
        3 讨论
            3.1 FdC2及RFNR在文心兰抵抗软腐病胁迫中发挥重要作用
            3.2 FdC2和RFNR均参与文心兰类原球茎的生长发育
第五章 CRISPR/Cas9 介导的文心兰FdC2和RFNR的功能研究
    第一节 FdC2和RFNR的 CRISPR/Cas9 载体构建及原生质体制备
        1 材料与方法
            1.1 试验材料
            1.2 试验方法
        2 结果与分析
            2.1 文心兰FdC2及RFNR的 gDNA序列的获得
            2.2 sg RNA表达盒的扩增以及重组质粒的鉴定
            2.3 原生质体的制备
        3 讨论
            3.1 文心兰FdC2及RFNR的比较
            3.2 原生质体可作为文心兰遗传转化受体
    第二节 文心兰FdC2和RFNR基因编辑后的分子检测及形态观察
        1 材料与方法
            1.1 检测材料
            1.2 试验方法
        2 结果与分析
            2.1 CRISPR/Cas9 介导的FdC2和RFNR转化及Cas9 的PCR检测
            2.2 转化后文心兰FdC2和RFNR的高分辨率溶解曲线（HRM）检测结果
            2.3 转基因文心兰FdC2和RFNR基因编辑效果的检测
            2.4 转基因文心兰FdC2和RFNR基因被编辑后序列的分析
            2.5 FdC2和RFNR基因编辑后文心兰类原球茎的形态观察
        3 讨论
            3.1 FdC2 参与文心兰类原球茎的分化
            3.2 RFNR基因参与文心兰类原球茎的发育过程
第六章 Fd3和LFNR转基因文心兰类原球茎的形态观察
    1 材料方法
    2 结果分析
        2.1 基因表达分析
        2.2 形态发育观察
    3 讨论
        3.1 Fd3和LFNR参与文心兰类原球茎的发育过程
        3.2 Fd3和LFNR显著影响文心兰类原球茎发育的分子细胞学机制
第七章 结论与展望
    1 结论
    2 展望
参考文献
在硕士学习期间发表学术论文情况
在硕士学习期间参加学术会议情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究[J]. 郭晔,万东艳,柴壮壮,王跃进,文颖强.  园艺学报. 2019(04)
[2]植物基因组编辑检测方法[J]. 刘春霞,耿立召,许建平.  遗传. 2018(12)
[3]CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑技术研究进展[J]. 时欢,林玉玲,赖钟雄,杜宜殷,黄鹏林.  应用与环境生物学报. 2018(03)
[4]橄榄查尔酮异构酶基因CHI的密码子偏好模式[J]. 赖瑞联,冯新,陈瑾,韦晓霞,陈义挺,吴如健.  应用与环境生物学报. 2017(05)
[5]南茜文心兰软腐病病原分离鉴定及致病性分析[J]. 杨学,叶炜,李永清,江金兰,曹奕鸯,雷伏贵.  亚热带植物科学. 2017(03)
[6]CRISPR-Cas系统在植物基因组编辑中的研究进展[J]. 王春,王克剑.  生物工程学报. 2017(10)
[7]基因编辑技术及其在园艺作物中的应用和展望[J]. 崔霞,张率斌.  园艺学报. 2017(09)
[8]植物CPR基因密码子偏好性及聚类分析[J]. 程丽,李宜奎,李晓丹,钱彬彬,徐晟,夏冰,汪仁.  分子植物育种. 2017(05)
[9]霍山石斛转录因子MYB1R1密码子选用偏好性分析[J]. 谢析颖,李蓉,林玉玲,郭容芳,陈裕坤,赖钟雄,徐涵.  分子植物育种. 2017(05)
[10]香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立[J]. 胡春华,邓贵明,孙晓玄,左存武,李春雨,邝瑞彬,杨乔松,易干军.  中国农业科学. 2017(07)

博士论文
[1]CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用[D]. 邢慧丽.中国农业大学 2017
[2]CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D]. 朱金洁.中国农业大学 2015
[3]CRISPR/Cas9基因定点突变体系构建与大豆抗旱相关gma-miR160功能研究[D]. 孙现军.西北农林科技大学 2015
[4]龙眼胚性培养物抗性相关基因的克隆与功能鉴定[D]. 叶炜.福建农林大学 2015
[5]稻瘟菌诱导性水稻OsFd和OsFNR基因的cDNA克隆与诱导表达[D]. 耿丽华.山东农业大学 2004

硕士论文
[1]文心兰离体培养优化及转化铁氧还蛋白基因研究[D]. 吴晓佩.福建农林大学 2017
[2]霍山石斛生物钟相关基因克隆及其与培养物糖含量分析[D]. 谢析颖.福建农林大学 2017
[3]文心兰OnACO2与OnERS1基因的克隆及表达分析[D]. 田晓岩.海南大学 2015
[4]拟南芥CBF3基因转化文心兰的研究[D]. 甘露.海南大学 2010
[5]根癌农杆菌介导ACS反义基因转化文心兰的研究[D]. 金苹.福建农林大学 2009



本文编号：3162683