棉花开花时间相关基因的挖掘与功能分析

发布时间：2021-04-28 11:03

　　棉花是世界重要经济作物之一,棉籽油的生产和棉纤维的供给对于工商业都具有非凡的意义。在我国,棉花同样是重要的农业经济作物,然而,基于我国耕地面积紧张、人口基数大的国情,棉花的种植面积极为受限,粮棉争地矛盾突出。开花意味着植物开始以生殖生长为生长中心,早花可以促进早熟,实现植物生育期的缩短。因此,从棉花花期调控角度入手,攻克棉花开花调控关键机制,实现棉花优质短季棉的培育是缓解当前土地局势,优化农业种植结构,实现高产高效的重要方法之一。前人研究表明,花期调控已逐步研究解析多种调控路径,每个路径都有其关键基因所在,例如FLC基因在春化途径中具有重要作用,对成花起着负调控的作用;CO基因在光周期途径中具有重要意义,是外界光周期变化与植物自身开花调控的维系等。本实验从棉花花芽启动的关键时期入手,通过转录组测序、超表达技术、CRISPR/Cas9基因编辑技术、matting法酵母文库筛选实验技术和亚细胞定位技术等手段,进行从面到点的分析研究,主要研究成果如下:（1）通过将花芽形成过程进行时期切割,细分为花芽未分化、即将分化、开始分化和分化完成四个时期,以转录组测序的技术手段,关注花芽形成过程中转录组... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

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符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 花的形成
        1.1.1 成花诱导与成花启动
        1.1.2 花器官发育
    1.2 开花控制途径
        1.2.1 光周期途径
        1.2.2 春化作用途径
        1.2.3 赤霉素诱导途径
        1.2.4 温敏途径
        1.2.5 年龄途径
        1.2.6 自主途径
    1.3 调控植物开花时间的相关研究现状
    1.4 转录组测序技术
    1.5 酵母双杂交系统
        1.5.1 酵母双杂交系统
        1.5.2 核体系酵母文库与膜体系酵母文库
    1.6 亚细胞定位
    1.7 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
        1.7.1 CRISPR/Cas9 系统的发现和原理
        1.7.2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的功能和应用
    1.8 本研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验时间、地点与实验材料
        2.1.1 实验时间和地点
        2.1.2 实验材料
    2.2 棉花不同花芽分化时期的茎尖材料取样
    2.3 棉花不同花芽分化时期转录组测序
        2.3.1 总RNA的分别提取
        2.3.2 RNA-seq文库构建与测序
        2.3.3 序列比对与分析
        2.3.4 基因表达量统计与功能注释
    2.4 超表达载体构建及转化
        2.4.1 目的基因克隆
        2.4.2 DH5α大肠杆菌感受态制备
        2.4.3 TOPO载体构建及转化大肠杆菌
        2.4.4 质粒小提
        2.4.5 以LR反应进行超表达载体的构建及转化大肠杆菌
        2.4.6 农杆菌感受态制备
        2.4.7 超表达载体转入农杆菌
        2.4.8 花粉管通道法转化棉花并收取种子
        2.4.9 蘸花法转化拟南芥并收取种子
    2.5 CRISPR/Cas9 基因编辑载体构建及转化
        2.5.1 sgRNA的设计
        2.5.2 CRISPR/Cas9 表达载体的引物设计
        2.5.3 CRISPR/Cas9 插入片段的制备
        2.5.4 载体线性化
        2.5.5 一步克隆法连接插入片段与线性化载体
        2.5.6 农杆菌转化
    2.6 matting法双杂交文库筛选
        2.6.1 酵母感受态制备
        2.6.2 BD载体构建
        2.6.3 诱饵基因自激活和毒性检测
        2.6.4 matting法双杂交文库筛选
    2.7 亚细胞定位
3 结果与分析
    3.1 转录组测序数据及分析
        3.1.1 转录组下机数据统计
        3.1.2 测序质量评估
        3.1.3 基于表达量的测序评估
        3.1.4 样品相关性分析
        3.1.5 基因表达差异分析
        3.1.6 差异表达基因的GO富集分析
        3.1.7 差异表达基因的KEGG Pathway富集分析
        3.1.8 可变剪切及新转录本分析
        3.1.9 基于表达量的差异基因分析与候选基因选定
    3.2 候选基因的表达模式验证和分析
        3.2.1 转录组测序数据验证
        3.2.2 不同组织和处理条件下候选基因的表达模式分析
    3.3 候选基因的超表达实验
        3.3.1 候选基因的克隆
        3.3.2 表达载体的构建和检验
        3.3.3 表达载体的遗传转化
    3.4 候选基因的CRISPR/Cas9 基因编辑实验
        3.4.1 靶标选择和引物设计
        3.4.2 表达载体的构建
        3.4.3 表达载体的验证和转化
        3.4.4 表达载体的遗传转化
    3.5 候选基因的matting法双杂交文库筛选
        3.5.1 候选蛋白的跨膜区分析
        3.5.2 诱饵基因自激活检测和毒性检测
        3.5.3 互作蛋白的筛选
    3.6 候选基因结构分析和亚细胞定位验证
        3.6.1 候选蛋白的Pfam分析
        3.6.2 候选蛋白的信号肽分析
        3.6.3 候选蛋白的亚细胞定位
        3.6.4 候选蛋白的蛋白修饰分析
4 讨论
    4.1 基于转录组测序数据的差异基因表达特征分析
    4.2 基于转录组测序数据的可变剪切分析
    4.3 候选基因的作用机理预测分析和蛋白互作实验选择
    4.4 棉花花期调控研究的重要性
5 结论
6 参考文献
7 致谢
8 攻读学位期间发表论文情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]基因编辑技术在作物育种上的应用研究进展[J]. 肖义军,黄艳萍.  生物学教学. 2019(11)
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[5]可变剪切在动植物中的研究进展[J]. 逄洪波,解元坤,李嘉琦,李玥莹,陈强.  基因组学与应用生物学. 2020(04)
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博士论文
[1]Split-ubiquitin膜蛋白酵母双杂交系统的构建及其应用[D]. 曹炜.复旦大学 2007

硕士论文
[1]玉米ZmHAK1与ZmCIPK23蛋白相互作用研究[D]. 赵可菡.吉林大学 2019
[2]碱蓬脱水素蛋白（SsDHN）的亚细胞定位及功能研究[D]. 马宝月.沈阳农业大学 2019
[3]水稻miRNAs靶基因验证瞬时表达系统的构建及应用[D]. 曹雅倩.中国农业科学院 2018
[4]水稻膜系统酵母双杂交cDNA文库及OsVDAC5诱饵蛋白载体的构建与鉴定[D]. 陈利维.中南民族大学 2014
[5]以肠道病毒71型3C蛋白酶为靶点的药物筛选模型的建立及药物筛选[D]. 秦咸蕴.曲阜师范大学 2011



本文编号：3165364