利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7细胞株

发布时间：2021-04-28 14:58

　　目的利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬细胞株,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能奠定基础。方法根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别4.1R基因的向导RNA（sgRNA）,构建sgRNAlenti CRISPRv2重组质粒并转入293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒侵染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆,Western blotting印记检测单克隆细胞中蛋白4.1R的表达,测序确认单克隆细胞中突变位点。结果 Western blotting印迹检测结果表明筛选出的1株单克隆细胞中蛋白4.1R的表达完全缺失;测序结果表明该细胞株中4.1R基因发生了19bp的缺失突变;并且4.1R基因敲除后,RAW264.7细胞的增殖能力显著增加。结论本研究利用CRISPR/Cas9系统成功的干扰了巨噬细胞系RAW264.7细胞中4.1R的表达,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能提供了有效工具。 

【文章来源】：南方医科大学学报. 2017,37(12)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料与试剂
    1.2 方法
        1.2.1 sg RNA的设计和寡核苷酸链的合成
        1.2.2 重组真核表达质粒lenti CRISPRv2-sgRNA构建
        1.2.3 293T细胞培养与慢病毒制备
        1.2.4 RAW264.7细胞培养与慢病毒侵染
        1.2.5 敲除4.1R基因的RAW264.7细胞株的单克隆筛选
        1.2.6 敲除4.1R基因的RAW264.7细胞株的鉴定
        1.2.7 CCK8细胞增殖实验
        1.2.8 统计学处理
2 结果
    2.1 sg RNA靶点的选择及寡核苷酸链设计
    2.2 Lenti CRISPRv2-sg RNA载体的构建
    2.3 稳定敲除4.1R基因的RAW264.7细胞株的鉴定
    2.4 敲除4.1R基因的RAW264.7细胞增殖能力检测
3 讨论



本文编号：3165682