PPP1R13L基因可变剪接在多环芳烃类所致肺癌变过程中的特征分析及机制研究

发布时间：2021-04-29 05:49

　　目的:近年来,肺癌以其不断攀升的发病率和死亡率迅速成为全球范围内严重威胁人类健康的恶性疾病之一。因此,找寻在肺癌发生发展过程中的有效生物学标志对提高肺癌患者的生命质量和生存时间具有非常重要的意义。pre-mRNA的可变剪接是控制基因表达和产生蛋白质多样性的重要机制,也是引起癌症表达的天然来源。许多癌基因受可变剪接调控,而某一个或某些可变剪接异构体的转换,可能在肿瘤发生、发展中起关键作用,成为癌症的特异性可变剪接模式。PPP1R13L是一种新的癌基因,存在2个常见可以编码蛋白的可变剪接异构体PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV,两者在环境致癌物所致肺癌的发生发展中可能发挥不同的生物学功能,呈现出某种肺癌特异性可变剪接模式。本研究通过基因芯片和生物数据库等方法筛选与肺癌相关的癌基因PPP1R13L的可变剪接异构体,并采用临床肺癌及癌旁组织样本、BPDE诱导细胞恶性转化模型及体外细胞转染模型深入挖掘和探讨PPP1R13L基因两个候选可变剪接异构体在肺癌变过程中的特征表达和相关机制。阐明高表达PPP1R13L-SV可以通过抑制P53的凋亡功能,促进细胞恶性转变,认为PPP1R13L-S... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：106 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 PPP1R13L可变剪接异构体在肺癌组织中的表达及其特征分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 研究对象的确定
            2.2.2 Affymetrix基因芯片和UCSC数据库筛选PPP1R13L可变剪接异构体
            2.2.3 组织样本DNA提取
            2.2.4 DNA及RNA扩增引物信息
            2.2.5 DNA扩增
            2.2.6 组织总RNA提取
            2.2.7 实时定量PCR检测
            2.2.8 组织蛋白提取及Western blot
            2.2.9 5'-RACE-Ready cDNA末端扩增检测
        2.3 统计学方法
    3 结果
        3.1 基因芯片及生物信息学筛选PPP1R13L可变剪接异构体
        3.2 肺癌、癌旁及远端(非癌)组织中PPP1R13L-L和PPP1R13L-SVmRNA及蛋白表达水平
        3.3 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53在肺癌组织与癌旁组织中mRNA表达水平
        3.4 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53基因mRNA表达水平与肺癌临床病理特征关联性的分层分析
        3.5 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53蛋白在肺癌组织与癌旁组织中的表达
        3.6 PPP1R13L-L、PPP1R13L-SV和P53表达水平与肺鳞癌临床病理特征的关联性
        3.7 PPP1R13L可变剪接异构体在肺鳞癌中的表达与P53之间的相关性
    4 讨论
第二部分 PPP1R13L可变剪接异构体在BPDE所致人正常支气管上皮永生化细胞恶性转化过程中的特征分析
    5 前言
    6 材料与方法
        6.1 主要试剂和仪器
            6.1.1 主要试剂
            6.1.2 主要仪器
            6.1.3 细胞来源
        6.2 实验方法
            6.2.1 细胞的复苏与传代培养
            6.2.2 CCK8试验筛选BPDE对16HBE细胞恶性转化的诱导剂量
            6.2.3 16HBE细胞恶性转化模型的构建
            6.2.4 划痕实验
            6.2.5 Transwell小室体外侵袭实验
            6.2.6 软琼脂克隆实验
            6.2.7 裸鼠成瘤实验
            6.2.8 成瘤组织HE染色
            6.2.9 成瘤组织免疫组化
            6.2.10 实时定量PCR检测不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53 mRNA表达
            6.2.11 蛋白免疫印迹法检测不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表达
            6.2.12 统计学方法
    7 结果
        7.1 不同代数恶性转化细胞的迁移能力
        7.2 不同代数恶性转化细胞的侵袭能力
        7.3 恶性转化不同代数细胞的恶性增殖能力
        7.4 恶性转化细胞皮下致瘤
        7.5 恶性转化细胞的病理学鉴定
            7.5.1 成瘤组织病理分析
            7.5.2 成瘤组织免疫组化鉴定
        7.6 恶性转化细胞P53基因型分析
        7.7 不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53mRNA表达水平
        7.8 不同代数恶性转化细胞PPP1R13L-L,PPP1R13L-SV和P53蛋白表达
    8 讨论
第三部分 构建体外细胞转染模型分析PPP1R13L两种不同可变剪接模式在肺癌变中的作用及机制
    9 前言
    10 材料与方法
        10.1 主要试剂和仪器
            10.1.1 主要试剂
            10.1.2 主要仪器
            10.1.3 细胞来源
        10.2 实验方法
            10.2.1 构建PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV过表达质粒
            10.2.2 设计并筛选PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV短片断干扰RNA(siRNA)
            10.2.3 利用CRISPR-Cas9体系构建PPP1R13L-L转录本敲除细胞模型
            10.2.4 各质粒转染细胞效果的鉴定
            10.2.5 BPDE染毒处理转染细胞的凋亡检测
            10.2.6 BPDE染毒处理转染细胞的免疫荧光检测
            10.2.7 统计学方法
    11 结果
        11.1 PPP1R13L-L和PPP1R13L-SV在各转染细胞中mRNA及蛋白表达水平
        11.2 PPP1R13L不同可变剪接模式与细胞凋亡的关系
        11.3 siRNA干扰PPP1R13L可变剪接异构体对P53核内表达的影响
        11.4 外源性质粒过表达PPP1R13L不同可变剪接异构体对P53核内表达的影响
        11.5 CRISPR-Cas9体系内源性敲除PPP1R13L-L各转染细胞中PPP1R13L不同可变剪接异构体蛋白表达水平
        11.6 CRISPR-Cas9细胞模型中PPP1R13L不同转录本表达模式与细胞凋亡的关系
        11.7 CRISPR-Cas9细胞模型中PPP1R13L不同转录本表达模式对P53核内表达的影响
    12 讨论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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硕士论文
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[2]拟南芥形态和生理进化的比较研究[D]. 刘阳.山东农业大学 2015
[3]p53凋亡刺激蛋白抑制因子（IASPP）在胶质瘤中的表达及其作用机制的研究[D]. 潘晓虎.苏州大学 2013
[4]癌基因iASPP-SV/iASPP在乳腺癌中的表达及其与P53关系的实验研究[D]. 赵燕仪.天津医科大学 2007



本文编号：3166966