CRISPR/Cas9系统介导的印记基因敲除小鼠制备的研究

发布时间：2021-05-01 01:15

　　基因组编辑技术尤其是新兴的CRISPR/Cas9系统,能高效地对基因组进行靶向修饰,理论上可以实现任何物种任何基因的编辑,对生命科学、医学等都展示出巨大的研究价值。传统的基因打靶技术依赖于DNA片段的同源重组,效率低（低于10-6）。相对于ZFNs和TALENs的复杂组装,CRISPR/Cas9系统依靠guide RNA和Cas9蛋白就可以实现基因定点编辑,具有构建简单、打靶效率高、成本低等优点。本实验设计利用CRISPR/Cas9系统分别在小鼠ES细胞和胚胎水平实现基因定点敲除,并获得单等位基因敲除小鼠模型。本课题以小鼠母源印记基因Kcnq1ot1作为敲除对象。该基因位于Kcnq1ot1印记基因簇中并起调控作用。本课题第一条技术路线为ES细胞介导的囊胚注射法制备转基因小鼠,策略为敲除Kcnq1ot1启动子以及其起始部位共3.7 kb长DNA片段,并敲入puroeGFP。在敲除片段5’和3’端各找了3个靶位点并成功构建基于靶位点的6个gRNA和打靶载体Kcnq1ot1-puro-eGFP-pGalk。将打靶载体、Cas9表达质粒和5’gRNA-1及3’gRNA-1共转染至小鼠ES细胞,... 

【文章来源】：河南大学河南省

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 基因组编辑技术
        1.1.1 锌指核酸酶技术
        1.1.2 类转录激活因子效应物核酸酶技术
        1.1.3 CRISPR/Cas9系统
    1.2 几种常用的动物转基因技术
        1.2.1 胚胎干细胞介导的囊胚注射法
        1.2.2 基于受精卵的原核注射或胞质注射
        1.2.3 体细胞核移植
    1.3 基因组编辑技术的应用
        1.3.1 研究基因功能
        1.3.2 基因治疗
        1.3.3 制备医学动物疾病模型
        1.3.4 利用基因组编辑技术改良动物遗传性状
    1.4 印记基因和细胞重编程
    1.5 立题依据和研究意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 载体
        2.1.2 菌株、细胞系和小鼠品系
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 常用培养基和缓冲液的配制
        2.1.6 引物序列(金唯智)
    2.2 实验方法
        2.2.1 打靶载体的制备
        2.2.2 gRNA的构建
        2.2.3 小鼠成纤维细胞的制备
        2.2.4 小鼠ES细胞培养
        2.2.5 小鼠ES细胞电转染
        2.2.6 阳性ES细胞筛选
        2.2.7 ES细胞介导的囊胚注射及子宫移植
        2.2.8 受精卵介导的原核注射及输卵管移植
3 结果与分析
    3.1 ES细胞介导的敲除小鼠制备结果
        3.1.1 ES细胞水平CRISPR/Cas9系统介导的Kcnq1ot1基因敲除
        3.1.2 gRNA构建结果
        3.1.3 囊胚注射及嵌合体小鼠
    3.2 受精卵原核注射介导的敲除小鼠制备的结果
        3.2.1 胚胎水平载体构建及gRNA效率检测结果
        3.2.2 原核注射结果
4 讨论
    4.1 关于CRISPR/Cas9系统
    4.2 制作动物模型方法的比较
    4.3 动物模型
5 结论
参考文献
致谢
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本文编号：3169854