毛果杨PtrVCS2基因在木材形成中的功能研究

发布时间：2021-05-06 05:49

　　木材是维管形成层分化产生的次生木质部不断沉积、累加的结果。转录因子在木材形成过程中发挥着关键调控作用。在前期研究工作中,本实验室筛选出87个毛果杨（Populus tichocarpa）维管形成层表达的转录因子基因。这些转录因子可能参与调控木材形成。本研究聚焦VCS2（Vascular Cambium Specific2）转录因子基因,解析了其在木材形成中的调控功能。本研究首先构建PtrVCS2融合GFP蛋白的瞬时表达载体,并利用毛果杨木质部原生质体系统进行亚细胞定位,结果PtrVCS2基因显示在细胞核、细胞质、细胞膜中均有表达,表明它可能具有独特的转录调控活性。同时利用原位杂交技术检测其组织表达模式,结果显示PtrVCS2基因主要在形成层中表达,在木质部和韧皮部也有部分表达。本研究对PtrVCS2基因进行毛果杨体内功能的研究,构建了PtrVCS2过表达载体及CRISPR载体,进行毛果杨的快速遗传转化。通过对转基因植株进行不同水平的分子检测及测序的鉴定,获得了PtrVCS2基因的过表达植株及突变体植株。对转基因植株进行表型分析,发现PtrVCS2过表达植株明显矮于野生型毛果杨,且Ptr... 

【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 引言
    1.2 树木木材的形成
        1.2.1 维管形成层的发育
        1.2.2 维管形成层发育的转录调控
        1.2.3 次生木质部分化
        1.2.4 次生木质部分化的转录调控
    1.3 植物转录因子的结构与分类
    1.4 植物ZF-HD基因家族简介
        1.4.1 植物ZF-HD转录因子的起源于进化
        1.4.2 ZF-HD转录因子结构与分类
        1.4.3 植物ZF-HD转录因子家族功能
    1.5 本研究的目的与意义
    1.6 本研究的技术路线
2 PtrVCS2基因的克隆及表达分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及载体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要仪器设备
        2.1.5 药品及培养基配置
    2.2 实验方法
        2.2.1 RNA-seq数据查找PtrVCS2基因及基因克隆
        2.2.2 毛果杨PtrVCS2基因瞬时表达载体构建及亚细胞定位
        2.2.3 毛果杨PtrVCS2基因的原位杂交
    2.3 结果与分析
        2.3.1 RNA-seq数据查找PtrVCS2基因及基因克隆
        2.3.2 毛果杨PtrVCS2基因的亚细胞定位
        2.3.3 毛果杨PtrVCS2基因的原位杂交
    2.4 本章小结
3 毛果杨PtrVCS2基因过表达载体构建及遗传转化
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株及载体
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要仪器设备
        3.1.5 药品及培养基配置
    3.2 实验方法
        3.2.1 毛果杨PtrVCS2基因过表达载体构建
        3.2.2 过表达PtrVCS2基因的遗传转化
        3.2.3 转录水平鉴定转基因植株
    3.3 结果与分析
        3.3.1 毛果杨PtrVCS2基因过表达载体构建
        3.3.2 过表达PtrVCS2基因的遗传转化
        3.3.3 RNA水平鉴定转基因植株
    3.4 本章小结
4 基于CRISPR/Cas9创制毛果杨-PtrVCS突变体
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株及载体
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 主要仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 SgRNA编辑效率的CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物体外检测
        4.2.2 毛果杨-PtrVCS2基因CRISPR载体构建
        4.2.3 毛果杨的遗传转化创制PtrVCS2的突变体
        4.2.4 PtrVCS2突变体的鉴定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 SgRNA编辑效率的CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物体外检测
        4.3.2 毛果杨-PttVCS2基因CRISPR载体构建
        4.3.3 毛果杨的遗传转化创制PtrVCS2的突变体
    4.4 本章小结
5 毛果杨PtrVCS2基因功能的分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器设备
    5.2 实验方法
        5.2.1 PtrVCS2转基因毛果杨生长指标的测定
        5.2.2 PtrVCS2转基因木质部扫描电镜观察
        5.2.3 转基因毛果杨组织切片化学染色
    5.3 结果与分析
        5.3.1 PtrVCS2转基因毛果杨表型及生长状况的分析
        5.3.2 PtrVCS2转基因毛果杨木质部扫描电镜观察
        5.3.3 转基因毛果杨组织切片化学染色
    5.4 本章小结
6 酵母双杂筛选毛果杨PtrVCS2互作基因
    6.1 实验材料
        6.1.1 菌株及载体
        6.1.2 主要试剂
        6.1.3 主要仪器设备
        6.1.4 药品及培养基配置
    6.2 实验方法
        6.2.1 构建PtrVCS2基因BD载体
        6.2.2 酵母感受态的制备
        6.2.3 PtrVCS2基因酵母自激活检测
        6.2.4 PtrVCS2基因酵母双杂筛选互作基因
        6.2.5 双分子荧光互补实验验证PtrVCS2互作基因
    6.3 结果与分析
        6.3.1 构建PtrVCS2基因BD载体
        6.3.2 PtrVCS2基因酵母自激活检测
        6.3.3 PtrVCS2基因酵母双杂交筛选互作基因
        6.3.4 双分子荧光互补实验验证PtrVCS2互作基因
    6.4 本章小结
讨论
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢



本文编号：3171361