转hCD47基因猪的创建及其在异种移植中抗吞噬作用研究

发布时间：2017-04-19 22:32

  本文关键词：转hCD47基因猪的创建及其在异种移植中抗吞噬作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径,猪因其器官大小、生理功能与人更为接近,被认为是人类异种器官移植的理想供体。然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白CD47(integrin associated protein,IAP),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除。本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪的基础上,转入人CD47(hCD47)基因,制备GTKO/hCD47基因修饰猪,以期避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬。本研究构建广泛性表达启动子CAG调控的hCD47基因表达载体p CAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪。利用PCR技术对克隆仔猪进行转基因鉴定,同时通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western Blot及免疫组化方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织中的表达。抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况。采用密度梯度离心法分离转基因猪的骨髓间充质干细胞(porcine bone marrow mesenchymal stem cells,pMSCs),利用流式细胞术检测pMSCs细胞表面标志CD29、CD34、CD44、CD45和CD90的表达。使用CFSE标记猪外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并通过流式细胞术检测猪PBMC与人巨噬细胞体外共孵育后的剩余率,以检测hCD47基因在抗巨噬细胞吞噬中的作用。上述研究结果具体如下:1.使用内切酶NheⅠ和XhoⅠ对hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo进行酶切验证及测序检测,结果表明载体pCAGGS-hCD47-Neo中各组成元件序列均正确。使用构建完成的hCD47基因表达载体体外转染猪耳成纤维细胞,24h后进行RT-PCR及Western Blot检测,结果表明,hCD47基因在耳成纤维细胞中具有明显的RNA及蛋白水平的表达。2.使用pCAGGS-hCD47-Neo载体转染猪耳成纤维细胞,通过G418筛选后共获得46个单细胞克隆,通过体细胞核移植获得重构胚,移植647枚胚胎到4头受体母猪。4头受体均妊娠至终期并自然产仔13头,经PCR鉴定显示13头仔猪均为阳性。3.通过qRT-PCR检测hCD47基因在转基因克隆仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等主要组织、器官中的表达。结果表明,hCD47基因在胰腺中的表达水平最高,其次分别为肝脏、肺脏、脾脏和肾脏,在心脏中的表达水平最低。4.通过对转基因克隆仔猪的心脏、肝脏和胰腺等组织样进行免疫组化及Western Blot检测,结果表明hCD47基因在胰腺及肝脏组织中具有明显的表达。5.通过对出生3个月、6个月的仔猪进行血液生理指标检测,结果显示,转hCD47基因克隆仔猪各项血液生理指标均符合文献报道的巴马小型猪血液生理指标参考范围,并与野生型巴马小型猪血液生理指标无显著差异(p0.05)。6.通过流式细胞术对pMSCs细胞表面标志进行检测,结果显示,pMSCs细胞表达CD29、CD44和CD90等标志,不表达CD34、CD45等标志。7.通过流式细胞术检测转hCD47基因猪的PBMC细胞及pMSCs细胞中hCD47的表达,结果显示,PBMC细胞及pMSCs细胞明显表达hCD47。8.THP-1来源的人巨噬细胞与猪PBMC细胞体外共孵育结果显示:表达hCD47基因的猪PBMC细胞在THP-1来源的人巨噬细胞中的存活率显著高于不表达hCD47基因的猪PBMC细胞(p0.05)。综上所述,本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,明确了hCD47基因在主要组织和细胞中的表达,初步验证了hCD47基因在抗人巨噬细胞吞噬中的作用,为探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植物的排斥反应中的作用提供模型。
【关键词】：hCD47基因 异种移植 巨噬细胞 基因表达 巴马小型猪
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R392.4
【目录】：

• 摘要4-6
• SUMMARY6-8
• 英文缩略表8-9
• 第一部分 文献综述9-16
• 1 CD47分子的基本特性9-10
• 1.1 CD47的发现9-10
• 1.2 CD47结构与分布10
• 2 CD47分子与整合素、TSP-1 及SIRPα 之间的相互作用10-13
• 2.1 CD47与整合素分子10-11
• 2.2 CD47与TSP-111
• 2.3 CD47与SIRPα11-13
• 3 CD47在移植领域中的研究13-15
• 3.1 CD47在移植中的研究13-14
• 3.2 CD47与免疫耐受14-15
• 4 研究目的及意义15-16
• 第二部分 广泛性表达hCD47转基因克隆猪制备16-35
• 1 实验材料16-20
• 1.1 动物性材料16
• 1.2 主要试剂及实验耗材16-17
• 1.3 主要仪器设备17-18
• 1.4 溶液的配制18-20
• 2 方法20-27
• 2.1 表达载体pCAGGS-hCD47-Neo的构建及鉴定20-22
• 2.1.1 表达载体pCAGGS-hCD47-Neo的构建20-21
• 2.1.2 载体pCAGGS-hCD47-Neo的鉴定21-22
• 2.2 阳性克隆点细胞转染、筛选及鉴定22-23
• 2.2.1 供体细胞的转染22
• 2.2.2 阳性克隆点细胞筛选22
• 2.2.3 阳性细胞鉴定22-23
• 2.3 转基因克隆胚胎的重构及胚胎移植23-24
• 2.3.1 转基因胚胎的重构23
• 2.3.2 胚胎移植和妊娠检测23-24
• 2.4 转hCD47基因仔猪鉴定24-26
• 2.4.1 DNA整合鉴定24
• 2.4.2 qRT-PCR分析24-25
• 2.4.3 Western Blot检测25
• 2.4.4 免疫组化检测25-26
• 2.5 仔猪血液生理指标检测26-27
• 3 结果与分析27-34
• 3.1 pCAGGS-hCD47-Neo载体酶切鉴定27-28
• 3.2 阳性克隆点细胞RT-PCR鉴定28
• 3.3 阳性克隆点细胞GGTA1基因流式分析28-29
• 3.4 转基因克隆胚胎移植后的体内发育29-30
• 3.5 仔猪DNA整合鉴定30
• 3.6 qRT-PCR检测各组织hCD47基因的表达30-31
• 3.7 Western Blot及免疫组化检测31-32
• 3.8 仔猪血液生理指标检测32-34
• 4 讨论34-35
• 第三部分 转hCD47基因猪的功能研究35-44
• 1 实验材料35-37
• 1.1 动物性材料35
• 1.2 主要试剂及实验耗材35-36
• 1.3 主要仪器设备36
• 1.4 溶液的配制36-37
• 2 方法37-39
• 2.1 转基因克隆猪pMSCS细胞的分离37
• 2.2 pMSCS细胞表面分子标志鉴定37-38
• 2.3 pMSCS及PBMC细胞hCD47的流式检测38
• 2.4 猪PBMC细胞剩余量检测38-39
• 2.4.1 猪PBMC细胞分离38
• 2.4.2 CFSE标记PBMC细胞38-39
• 2.4.3 THP-1 细胞诱导分化39
• 2.4.4 人巨噬细胞与猪PBMC体外共孵育39
• 3 结果与分析39-42
• 3.1 pMSCS细胞的体外培养39-40
• 3.2 pMSCS细胞表面标志测定40-41
• 3.3 转基因克隆猪pMSCS及PBMC细胞上hCD47的流式分析41-42
• 3.4 猪PBMC细胞剩余量检测结果及分析42
• 4 讨论42-44
• 第四部分 结论44-45
• 参考文献45-51
• 致谢51-52
• 作者简介52-53
• 导师简介53-54

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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  本文关键词：转hCD47基因猪的创建及其在异种移植中抗吞噬作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：317266