利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除BMDM巨噬细胞系

发布时间：2021-05-12 16:36

　　目的利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除骨髓衍生巨噬细胞系（BMDM）,为研究Nedd4在巨噬细胞中的作用和机制奠定基础。方法利用在线软件筛选了评分较高的3个针对Nedd4基因的单向导RNA（sgRNA）,然后将合成的sgRNA序列插入到PX330质粒中;将重组质粒转入BMDM细胞,通过有限稀释法获取单克隆,采用Western印迹检测单克隆细胞中NEDD4蛋白水平;通过序列测定确认单克隆细胞的DNA序列。结果通过Western印迹检测获取1株NEDD4蛋白缺失的BMDM细胞;测序结果表明该细胞系中Nedd4基因发生了16bp的缺失突变。结论利用CRISPR/Cas9技术构建的Nedd4敲除BMDM细胞系将成为研究Nedd4在巨噬细胞中的功能和机制的有力工具。 

【文章来源】：军事医学. 2017,41(04)北大核心CSCD

【文章页数】：4 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 细胞系和质粒
        1.1.2 实验试剂
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA的设计和寡核苷酸链的合成
        1.2.2 载体构建
        1.2.3 细胞转染
        1.2.4 Nedd4完全敲除细胞的筛选
2 结果
    2.1 PX330-Nedd4-sgRNA载体的构建
    2.2 PX330-Nedd4-sgRNA质粒转染BMDM细胞
    2.3 稳定敲除Nedd4的BMDM细胞株筛选
3 讨论



本文编号：3183751