玉米低温响应转录组及相关基因功能分析

发布时间：2021-05-13 20:51

　　低温是限制植物分布、生长发育和产量的重要因素。低温胁迫条件下,很多生物过程,如光合作用、蛋白质合成、膜脂代谢和次生代谢都会受到影响。生物膜是低温伤害的初始位点,低温时植物首先发生膜脂的物相变化,从液晶相转为凝胶相,植物对低温的抗性与膜脂的不饱和脂肪酸含量密切相关。玉米是全世界范围内种植面积最大的作物种类之一,也是我国重要的粮食作物、饲料作物和工业原料。玉米属于亚热带或热带作物,其最适生长温度在25-28℃之间,全生育期所需的积温大于10℃,当温度低于12℃时,玉米植株就很容易受到低温胁迫。在早春播种时,玉米经常遭受低温胁迫,影响种子萌发和幼苗生长,甚至会造成大面积的缺苗,导致播种时期延误,最终导致减产。因此,深入研究玉米耐低温的生理和分子机制具有重要的科学意义和实践价值。本研究利用玉米自交系为实验材料,从生理生化、转录组和分子生物学等方面探究其耐低温的机理,并筛选参与其耐低温的关键基因,为利用生物技术培育耐低温玉米新品系奠定基础。主要结果如下:（1）抗低温和不抗低温玉米自交系的筛选以102个玉米自交系为材料,4℃低温处理两周后,通过观察表型,先初步筛选出其中较抗低温的M54、W54、2... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：146 页

【学位级别】：博士

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符号说明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 低温胁迫对植物的影响
        1.1.1 低温胁迫对植物生物膜的影响
        1.1.2 低温对植物光合作用的影响
        1.1.3 低温对植物PSⅡ的影响
        1.1.4 低温对植物PSⅠ的影响
        1.1.5 低温条件下的光破坏防御机制
            1.1.5.1 依赖于叶黄素循环的热耗散
            1.1.5.2 活性氧清除系统
        1.1.6 植物抗低温分子生物学研究进展
    1.2 玉米低温胁迫研究进展
    1.3 次生代谢物质在作物抗逆中的作用
        1.3.1 植物酚类化合物的分类
        1.3.2 酚类化合物在植物中的生理功能
    1.4 MYB转录因子在植物抗逆中的作用及分子机理
    1.5 转录组测序技术研究进展
    1.6 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料及材料的培养方法
    2.2 实验方法
        2.2.1 耐低温和不耐低温玉米自交系的筛选
            2.2.1.1 幼苗生理指标的测定
            2.2.1.2 隶属函数综合评价方法
        2.2.2 低温胁迫下玉米生理指标的测定
            2.2.2.1 玉米荧光参数的测定
            2.2.2.2 玉米膜脂含量的测定
            2.2.2.3 玉米幼苗H_2O_2含量的测定
            2.2.2.4 玉米幼苗O_2~(·?)产生速率的测定
            2.2.2.5 玉米幼苗抗氧化酶活性的测定
            2.2.2.6 玉米幼苗总酚含量的测定
            2.2.2.7 玉米幼苗类黄酮含量的测定
        2.2.3 玉米转录组的测定及差异表达基因分析
            2.2.3.1 RNA的提取和纯化
            2.2.3.2 测序文库的构建和Illumina测序
            2.2.3.3 测序reads的去噪、拼接
            2.2.3.4 与参考基因组比对、表达量的计算及差异表达基因筛选
            2.2.3.5 差异表达基因的功能注释
        2.2.4 RealtimePCR验证转录组结果
        2.2.5 玉米MYB31和MYB-IF35基因的分离
            2.2.5.1 玉米总RNA的提取
            2.2.5.2 cDNA第一条链的合成
            2.2.5.3 cDNA纯化
            2.2.5.4 MYB31和MYB-IF35基因的克隆
        2.2.6 真核表达载体的构建
            2.2.6.1 正义表达载体的构建
            2.2.6.2 DNA序列测定
            2.2.6.3 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备与转化
        2.2.7 利用农杆菌介导法转化拟南芥
            2.2.7.1 花序侵染
            2.2.7.2 过表达株系的抗生素筛选
            2.2.7.3 过表达株系在DNA水平上的鉴定
        2.2.8 玉米MYB31和MYB-IF35基因的亚细胞定位
            2.2.8.1 pROKⅡ-GFP载体的构建
            2.2.8.2 pROKⅡ-GFP瞬时表达载体转化农杆菌
            2.2.8.3 pROKⅡ-GFP融合蛋白的亚细胞定位
        2.2.9 数据分析软件
3 结果与分析
    3.1 玉米抗低温和不抗低温自交系的筛选
        3.1.1 低温对玉米自交系生长状况的影响
        3.1.2 低温对玉米自交系生理指标的影响
        3.1.3 8个玉米自交系抗低温能力的综合评价
    3.2 低温对玉米自交系M54和753F生长及生理指标的影响
        3.2.1 低温处理不同时间对M54和753F中marker基因表达和幼苗生长的影响
        3.2.2 低温处理不同时间对M54和753F荧光参数的影响
        3.2.3 低温处理不同时间对M54和753F活性氧含量和抗氧化酶活性的影响
        3.2.4 低温处理不同时间对M54和753F类黄酮和总酚含量的影响
        3.2.5 低温处理不同时间对M54和753F膜脂和脂肪酸含量的影响
    3.3 利用高通量转录组测序预测玉米自交系抗低温的分子机理
        3.3.1 RNA-seq测序质量评估
        3.3.2 基因表达谱数据比对效率统计
        3.3.3 差异表达基因及其功能注释
        3.3.4 差异表达基因的GO及COG注释
        3.3.5 差异表达基因的KEGG注释
        3.3.6 RT-PCR验证转录组测序结果
        3.3.7 低温胁迫下光合作用过程相关差异表达基因的筛选
        3.3.8 低温胁迫下膜脂代谢过程相关差异表达基因的筛选
        3.3.9 低温胁迫下次生代谢过程相关差异表达基因的筛选
        3.3.10 低温胁迫下转录因子相关差异表达基因的筛选
    3.4 玉米次生代谢途径中参与抗低温关键基因的筛选及功能分析
        3.4.1 玉米次生代谢途径中参与抗低温关键基因的进一步筛选
        3.4.2 玉米MYB31和MYB-IF35基因的分离
        3.4.3 玉米MYB31和MYB-IF35基因一级结构和理化性质分析
        3.4.4 玉米MYB31和MYB-IF35蛋白与其他蛋白序列的同源性分析
        3.4.5 玉米MYB31和MYB-IF35基因的亚细胞定位
        3.4.6 玉米MYB31和MYB-IF35基因过表达载体的构建
        3.4.7 DNA水平上拟南芥过表达株系的筛选鉴定
        3.4.8 RNA水平上过表达株系的筛选鉴定
        3.4.9 MYB31和MYB-IF35的过量表达提高拟南芥的抗低温能力
            3.4.9.1 过量表达MYB31和MYB-IF35拟南芥的表型分析
            3.4.9.2 玉米MYB31和MYB-IF35的过量表达对低温胁迫下相对电导率的影响
            3.4.9.3 MYB31和MYB-IF35的过量表达对低温胁迫下PSⅡ光化学效率的影响
            3.4.9.4 MYB31和MYB-IF35的过量表达对低温胁迫下SOD和APX活性的影响
            3.4.9.5 MYB31和MYB-IF35的过量表达对低温胁迫下O2·?和H2O2含量的影响
4 讨论
    4.1 玉米自交系M54和753F的抗低温能力分析
    4.2 差异表达基因所在的通路与低温响应分析
        4.2.1 光合作用过程相关基因在玉米响应低温胁迫过程中发挥重要作用
        4.2.2 膜脂代谢过程相关基因可能参与玉米对低温胁迫响应
        4.2.3 次生代谢过程相关基因在玉米响应低温胁迫过程中发挥重要作用
    4.3 转录因子在玉米响应低温胁迫过程中发挥重要作用
    4.4 次生代谢途径中参与玉米低温响应的关键基因
5 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的论文及成果


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]西瓜低温响应MYB（Cla007586）转录因子的功能鉴定及互作蛋白分析[D]. 高凌云.华中农业大学 2016



本文编号：3184684