菠菜SpoPH1基因克隆及其高温应答功能分析

发布时间：2021-05-14 02:53

　　菠菜（Spinacia oleracea L.）是我国重要的经济型绿叶蔬菜之一,营养价值丰富,在全世界及我国范围内广泛种植。菠菜具有耐冷但不耐热的特性,高温胁迫严重影响菠菜的生长发育和产量,本文以耐热型菠菜Sp75和热敏感型菠菜Sp73为研究材料,利用分子生物学手段研究菠菜Spo PH1参与高温胁迫应答的分子机制,对提高菠菜产量及培育耐热菠菜新品种具有重要意义。PH结构域（Pleckstrin homology domain）,由100-120个氨基酸组成的功能性区域,是一种存在于多种信号蛋白和细胞骨架相关蛋白中的功能性区域,参与细胞信号传递,细胞骨架的构成,膜转运等。研究Spo PH1对高温应答调控作用将为深入解析植物高温应答分子机制提供重要参考依据。1.对菠菜全基因组数据库的分析发现,在菠菜基因组中存在2个编码PH蛋白的基因。利用分子PCR技术,克隆到了Spo PH1基因,其最大开放阅读框为450bp,共编码150个氨基酸,理论分子质量为17.4k Da。2.利用同源序列比对分析发现,Spo PH蛋白与多种植物的PH蛋白同源性都较高,都含有一个较为保守的PH结构域,说明PH结构域在... 

【文章来源】：上海师范大学上海市

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 引言
    1.2 高温胁迫对植物生长的影响
        1.2.1 高温胁迫影响植物的抗氧化系统
        1.2.2 高温胁迫影响植物渗透调节
        1.2.3 高温胁迫影响植物光合作用
    1.3 植物耐热机制的蛋白质组学进展
    1.4 植物耐热机制的分子生物学进展
    1.5 菠菜高温胁迫应答研究进展
        1.5.1 菠菜高温胁迫应答的信号通路
        1.5.2 菠菜高温胁迫应答的ROS清除途径
        1.5.3 高温胁迫诱导菠菜转录因子的调控与蛋白加工
    1.6 PH基因的生物学研究进展
        1.6.1 PH结构域
        1.6.2 PH结构域的功能
        1.6.3 含有PH结构域蛋白的功能
    1.7 研究目的及意义
第2章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及质粒载体
        2.1.3 实验试剂盒
        2.1.4 实验所需试剂及培养基的配制
        2.1.5 引物序列
    2.2 实验方法
        2.2.1 实验材料培养与处理
        2.2.2 菠菜SpoPH1 基因全长的克隆
        2.2.3 菠菜SpoPH1 生物信息学研究
        2.2.4 RT-qPCR
        2.2.5 载体构建
        2.2.6 农杆菌介导的烟草瞬时表达
        2.2.7 SpoPH1 转基因酵母耐热性分析
        2.2.8重组蛋白(His)6-SpoPH1 纯化和磷脂酰肌醇结合实验
        2.2.9 植物表达载体质粒转化农杆菌
第3章 结果
    3.1 菠菜SpoPH1 基因全长的克隆
        3.1.1 叶片RNA的提取
        3.1.2 菠菜SpoPH1 基因的克隆
    3.2 菠菜SpoPH1 基因的生物信息学分析
        3.2.1 SpoPH1 基因全长的序列分析
        3.2.2 PH蛋白的系统发育树分析
        3.2.3 PH蛋白家族多重序列比对
        3.2.4 SpoPH1 蛋白三维立体模型的构建
    3.3 菠菜Sp73和Sp75 高温处理下SpoPH1/SpoPH2 基因表达水平分析
    3.4 菠菜SpoPH1 不同发育时期的基因表达
        3.4.1 菠菜六叶期SpoPH1 在不同器官中的表达
        3.4.2 菠菜抽薹期SpoPH1 在不同器官中的表达
    3.5 SpoPH1 蛋白的亚细胞定位
        3.5.1 植物表达载体pBI121-SpoPH1-GFP的构建
        3.5.2 pBI121-SpoPH1-GFP质粒转化农杆菌
        3.5.3 SpoPH1 蛋白在烟草中的瞬时表达
    3.6 SpoPH1 转基因酵母的高温表型分析
        3.6.1 pYES2-SpoPH1 酵母表达载体的构建
        3.6.2 酵母表达载体pYES2-SpoPH1 转化野生型酵母
        3.6.3 SpoPH1 转基因酵母的高温表型分析
    3.7 菠菜SpoPH1 蛋白与磷脂酰肌醇的结合分析
        3.7.1 原核表达载体pET32a-SpoPH1 的构建
        3.7.2 SpoPH1 蛋白与磷脂酰肌醇的结合
    3.8 SpoPH1 过表达拟南芥的筛选
        3.8.1 植物表达载体pBI121-SpoPH1 的构建
        3.8.2 植物表达载体pBI121-SpoPH1 转化农杆菌
        3.8.3 SpoPH1 过表达拟南芥的筛选
    3.9 AtPH1 突变体的纯合验证
    3.10 SpoPH1 回补拟南芥AtPH1 突变体的鉴定
    3.11 菠菜SpoPH1 基因对拟南芥表型的影响
第4章 讨论
    4.1 菠菜SpoPH1的PH结构域特征
    4.2 菠菜SpoPH1 蛋白定位于细胞质
    4.3 菠菜SpoPH1 蛋白结合磷脂酰肌醇参与细胞信号转导
    4.4 菠菜SpoPH1 参与高温胁迫应答
    4.5 菠菜SpoPH1 影响拟南芥根的生长
第5章 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]高温胁迫对文冠果保护酶系统酶活性的影响研究[J]. 江萍,王小平,王雪莲,孙向宁,牛攀新,杜志敏.  北方园艺. 2008(01)
[2]温度胁迫对辣椒部分生理特性的影响[J]. 张子学,张蕊,隋益虎,崔广荣,张从宇.  安徽科技学院学报. 2007(03)
[3]葡萄对高温胁迫的生理学响应研究进展[J]. 刘海霞,李晓燕,李连国,王利军,李绍华.  内蒙古农业科技. 2007(02)
[4]PH结构域中的框架结构[J]. 纪秀娥,李莉莉,乔传英,朱美霞,黄江,陈良兵.  医学分子生物学杂志. 2007(02)
[5]高温胁迫下苜蓿生理生化特性研究[J]. 姜义宝,杨玉荣,王成章.  科学技术与工程. 2007(05)
[6]蔬菜作物高温逆境及其耐热性研究进展[J]. 王贵元,林小芳.  安徽农学通报. 2006(11)
[7]蔬菜高温逆境研究进展[J]. 吴俊华,侯雷平,李梅兰.  北方园艺. 2006(01)
[8]高温胁迫下不同茄子品种幼苗耐热性研究[J]. 贾开志,陈贵林.  生态学杂志. 2005(04)
[9]干旱地区造林树种的水分生理生态的研究进展[J]. 涂璟,王克勤.  西北林学院学报. 2003(03)
[10]超氧化物歧化酶（SOD）研究进展[J]. 杜秀敏,殷文璇,张慧,赵彦修.  中国生物工程杂志. 2003(01)



本文编号：3185132