柑橘原生质体瞬时转化体系优化及利用CRISPR/Cas9技术定点突变山金柑基因

发布时间：2021-05-14 10:51

　　柑橘是世界产量第一的水果,由于童期长、种子多胚、某些重要的商业品种育性低甚至不育等特点,利用传统的育种方法改良柑橘进展缓慢。CRISPR/Cas9系统作为近几年快速发展的基因组编辑技术可以精确有效地诱导特定的突变,特异地改造基因组,已成为植物基因功能研究和作物遗传改良的重要手段之一。利用植物原生质体瞬时转化CRISPR/Cas9系统突变得到的植株,属于非转基因种质资源,能够省去漫长的后代筛选步骤;同时相对于农杆菌介导转化柑橘上胚轴易产生嵌合体,原生质体瞬时转化CRISPR/Cas9系统是对于单个细胞进行基因编辑,得到纯合子的概率大大提高。由于柑橘原生质体瞬时转化体系尚未成熟,本研究旨在优化柑橘原生质体瞬时转化体系,提高柑橘叶肉原生质体瞬时转化效率,以充分利用亚细胞定位、双分子荧光互补（BiFC）实验对柑橘本物种基因进行功能研究;提高柑橘愈伤组织原生质体瞬时转化效率,以利用CRISPR/Cas9系统改良柑橘种质;引进3种不同的CRISPR/Cas9载体的构建体系,并利用农杆菌介导山金柑上胚轴的遗传转化法对目的基因CsP5CS2进行敲除,以期得到阳性植株用于后期的基因功能研究。实验结果包括... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
    1.1 课题的提出
    1.2 植物原生质体研究进展
        1.2.1 植物原生质体特点
        1.2.2 植物原生质体分离
        1.2.3 植物原生质体转化方法
        1.2.4 PEG介导的植物原生质体瞬时转化效率
        1.2.5 植物原生质体瞬时转化的应用
    1.3 CRISPR/Cas9系统的发展与应用
        1.3.1 基因组编辑技术概述
        1.3.2 CRISPR/Cas9系统的作用机制
        1.3.3 CRISPR/Cas9系统的优化与发展
        1.3.4 CRISPR/Cas9系统在植物基因组编辑中的应用
    1.4 柑橘CRISPR/Cas9系统的研究进展
    1.5 本实验研究的目的及内容
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株与载体
        2.1.3 主要试剂与酶
        2.1.4 培养基与溶液配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 载体构建方法
            2.2.1.1 CRISPR/Cas9载体pRGE31-CsP5CS2
            2.2.1.2 CRISPR/Cas9载体pKSE-GFP-CsP5CS2
            2.2.1.3 亚细胞定位载体
        2.2.2 柑橘原生质体提取与纯化
        2.2.3 柑橘原生质体瞬时转化方法
        2.2.4 根癌农杆菌介导的遗传转化法
        2.2.5 柑橘U6启动子CsU6的扩增
3 结果与分析
    3.1 原生质体提取与纯化步骤优化
    3.2 原生质体瞬时转化效率的影响因素评价
        3.2.1 原生质体材料来源
        3.2.2 共转化处理方式
        3.2.3 PEG溶液Ca~(2+)浓度
    3.3 利用柑橘原生质体研究蛋白质的亚细胞定位
    3.4 利用柑橘原生质体研究蛋白质互作-BiFC
    3.5 CRISPR/Cas9载体构建
        3.5.1 利用tRNA-gRNA体系构建CsSPL基因单靶位点编辑载体
        3.5.2 利用tRNA-gRNA体系构建CsP5CS2基因双靶位点编辑载体
        3.5.3 构建pKSE-GFP-CsP5CS2编辑载体
        3.5.4 构建Cas9/CsU6体系编辑载体
    3.6 根癌农杆菌介导山金柑上胚轴的遗传转化
        3.6.1 转基因过程
        3.6.2 转基因阳性植株序列分析
4 讨论
    4.1 柑橘原生质体瞬时转化体系比较
    4.2 3种不同CRISPR/Cas9载体比较
    4.3 柑橘愈伤组织原生质体瞬时转化效率低的可能原因
参考文献
附录 Ⅰ 培养基配方
附录 Ⅱ 溶液配方
附录 Ⅲ 柑橘原生质体瞬时转化方法二
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]植物CRISPR基因组编辑技术的新进展[J]. 李红,谢卡斌.  生物工程学报. 2017(10)
[2]基因组编辑技术在植物基因功能鉴定及作物育种中的应用[J]. 周想春,邢永忠.  遗传. 2016(03)
[3]木本植物原生质体培养体系研究进展[J]. 彭邵锋,陆佳,陈永忠,王瑞,陈隆升,马力,王湘南.  中国农学通报. 2013(01)
[4]植物蛋白质的亚细胞定位研究进展[J]. 邢浩然,刘丽娟,刘国振.  华北农学报. 2006(S2)
[5]世界柑橘品种改良的进展[J]. 邓秀新.  园艺学报. 2005(06)
[6]植物体细胞原生质体遗传转化研究[J]. 赵宏波,陈发棣.  西北植物学报. 2004(07)

博士论文
[1]柑橘珠心胚起始相关miRNA挖掘与csi-miR156a调控体细胞胚发生作用机理[D]. 龙健梅.华中农业大学 2017
[2]CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhCLA1和GhVP基因编辑的研究[D]. 陈修贵.华中农业大学 2017
[3]CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D]. 朱金洁.中国农业大学 2015
[4]转基因调控柑橘类胡萝卜素积累的细胞学和代谢研究[D]. 曹洪波.华中农业大学 2012

硕士论文
[1]柑橘原生质体瞬时表达体系的建立及默科特橘橙转GFP种质的创造[D]. 张倩.华中农业大学 2009



本文编号：3185518