耐高糖酿酒酵母菌株的筛选及性状诱发基因的功能研究

发布时间：2021-05-18 16:03

　　随着全球石化能源总量不断地减少,人类需求不断地增加,寻找新的替代能源是人类必须要解决的重大问题,生物燃料乙醇以其绿色环保、可再生等特点得到人们广泛的关注,中国已成为世界上继巴西、美国之后第三大生物燃料乙醇生产国和应用国。目前,世界上生产的燃料乙醇几乎全部都是由酿酒酵母发酵产生的,可见高性能的酿洒酵母菌株是燃料乙醇产业发展的重要因素。发酵过程中,酿酒酵母细胞发酵产乙醇的能力以及对发酵环境中各种不利因素的耐受性是酵母细胞工业应用的重要指标。因此,获得乙醇发酵能力和耐受性增强的酿酒酵母菌株以及研究其高产和耐受的生理机制是一项非常有意义的工作。高浓度糖造成的高渗压力是酿酒酵母细胞工业应用中常遇到的一种环境压力,早期对酵母耐高渗机制的研究主要是针对盐和山梨醇形成的高渗环境,对高浓度糖形成的高渗耐受机制研究还不多。本研究以实验室之前筛选并保存的糖蜜乙醇发酵高产野生酿酒酵母菌株MF02为出发菌株,对其进行紫外诱变,筛选获得一株在40%（W/V）葡萄糖压力下生长和发酵产乙醇能力都比出发菌株提高的突变菌株UV02_HG。经测定,在YPD培养基中两菌株的生长曲线基本一致,突变菌株的平均... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：151 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 酿酒酵母糖发酵研究的发展史
    1.2 绿色新能源-燃料乙醇
    1.3 影响酿酒酵母乙醇发酵的因素
    1.4 酿酒酵母耐高渗机制的研究
        1.4.1 HOG途径上游信号转导机制
        1.4.2 HOG途径下游适应性应答
    1.5 基因表达量测定方法的发展
        1.5.1 Northern 印迹法
        1.5.2 RT-PCR
        1.5.3 微列阵芯片技术
        1.5.4 RNA-Seq
    1.6 酵母基因功能研究方法
    1.7 立项依据和研究内容
    1.8 技术路线
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 培养基
        2.1.3 菌种培养与保存
        2.1.4 酶与试剂
        2.1.5 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 紫外诱变及筛选
        2.2.2 菌株在YPD培养基中生长曲线的测定
        2.2.3 菌株在YP40培养基中生长曲线和发酵曲线的测定
        2.2.4 菌株在不同浓度葡萄糖固体培养基上的生长情况
        2.2.5 菌株乙醇耐受性的检测
        2.2.6 RNA的提取及质量检测
        2.2.7 转录组测序数据分析
        2.2.8 荧光定量PCR检测
        2.2.9 菌株相对呼吸强度的检测
        2.2.10 高糖胁迫下细胞膜透性的检测
        2.2.11 利用Cre/LoxP系统对STE12和TUP1基因进行敲除
        2.2.12 敲除株性状变化检测
        2.2.13 STE12和TUP1基因的回补表达
        2.2.14 回补表达菌株性状的检测
第三章 结果与分析
    3.1 紫外诱变菌株的筛选
    3.2 菌株UV02_HG和MF02在YPD培养基中的生长曲线
    3.3 菌株UV02_HG和MF02在YP40培养基中的生长和发酵曲线
    3.4 菌株MF02和UV02_HG在不同浓度葡萄糖固体培养基上的生长情况
    3.5 菌株MF02和UV02_HG乙醇耐受性的检测
    3.6 RNA提取及质量检测
    3.7 转录组测序及数据分析
        3.7.1 测序数据质量分析
        3.7.2 与参考基因组比对情况
        3.7.3 表达差异分析
        3.7.4 KEGG分析
        3.7.5 GO分析
        3.7.6 SNP分析
        3.7.7 PheNetic网络分析
    3.8 荧光定量PCR验证
    3.9 高糖压力下突变株UV02_HG和野生菌株MF02相对呼吸强度的检测
    3.10 高糖压力下突变菌株UV02_HG和野生菌株MF02细胞膜透性的变化
    3.11 STE12和TUP1基因的敲除
        3.11.1 两个基因的扩增
        3.11.2 敲除系统的构建
        3.11.3 酿酒酵母UV02_HG菌株单倍体细胞的制备
        3.11.4 敲除株的筛选及验证
        3.11.5 单倍体敲除株的复倍
        3.11.6 二倍体敲除株的消抗
    3.12 基因缺失菌株的性状检测
        3.12.1 基因缺失菌株在YPD培养基中的生长曲线
        3.12.2 基因缺失菌株在YP40中的生长和发酵曲线
        3.12.3 基因缺失菌株在不同浓度葡萄糖固体培养基上的生长情况
        3.12.4 基因缺失菌株乙醇耐受性的检测
        3.12.5 基因缺失菌株相对呼吸强度的检测
        3.12.6 基因缺失菌株在高糖压力下细胞膜透性的检测
    3.13 STE12和TUP1基因的回补表达
        3.13.1 STE12和TUP1的扩增
        3.13.2 表达组件的构建
        3.13.3 同源置换片段的转化及筛选
    3.14 回补菌株性状变化的检测
        3.14.1 基因缺失和基因回补菌株在YPD中的生长曲线
        3.14.2 基因缺失和基因回补菌株在YP40中的生长和发酵曲线
        3.14.3 基因缺失和基因回补菌株相对呼吸强度的检测
        3.14.4 基因缺失和基因回补菌株细胞膜透性的检测
第四章 讨论
    4.1 野生酿酒酵母菌株MF02和突变菌株UV02_HG性状及表达差异分析
        4.1.1 核糖体
        4.1.2 线粒体和氧化磷酸化
        4.1.3 糖代谢途径
        4.1.4 MAPK途径
        4.1.5 蛋白加工及运输
        4.1.6 突变菌株性状诱发因子分析
    4.2 STE12和TUP1基因对酿酒酵母菌株耐高糖性状的影响及功能分析
        4.2.1 STE12基因
        4.2.2 TUP1基因
第五章 总结
参考文献
附录
    附录Ⅰ 部分试剂的配置
    附录Ⅱ 部分基因测序序列
    附录Ⅲ 部分实验结果
致谢
攻读学位期间所发表的学术论文和研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]中国燃料乙醇发展现状及对石油行业的影响[J]. 费华伟,王利宁,赫春燕,陈蕊.  国际石油经济. 2017(11)
[2]两株高糖分利用能力的酿酒酵母呼吸突变体选育[J]. 韦缘,张穗生,陈东,陆琦,陈英,黄日波.  生物技术通报. 2012(07)
[3]氧化磷酸化抑制剂对光滑球拟酵母糖酵解速度的影响[J]. 刘立明,陈坚,李华钟,李寅.  生物化学与生物物理进展. 2005(03)



本文编号：3194082