利用CRISPR/Cas9在Bel-7402细胞中靶向敲除SMYD3基因的初步研究

发布时间：2021-05-20 17:17

　　目的:1.设计三个靶向于SMYD3基因的sgRNA。分别记为sgRNA#1、sgRNA#2和sgRNA#3。2.构建sgRNA#1-PX459、sgRNA#2-PX459和sgRNA#3-PX459重组质粒。3.检测SMYD3蛋白在HEK293T细胞和Bel-7402细胞中的表达情况。4.探索Lipofectamine?2000:1μg的sgRNA-PX459重组质粒最佳的包裹比例。5.比较不同浓度嘌呤霉素分别作用于HEK293T细胞和Bel-7402细胞,确定三天时最低致死浓度。6.比较CRISPR/Cas9打靶载体的活性。7.制备SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株。8.比较SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株与野生型Bel-7402细胞的增殖能力。9.比较SMYD3基因缺陷型Bel-7402细胞株与野生型Bel-7402细胞的迁移能力。方法:1.在GenBank网站,搜索人SMYD3基因序列。在http://crispr.mit.edu/网站,设计靶向于SMYD3基因的sgRNA。2.使PX459质粒线性化,把sgRNA连接入线性化的PX459,构建sgRNA-PX4... 

【文章来源】：山西医科大学山西省

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
常用缩写词中英文对照表
前言
1 实验材料
    1.1 细胞株
    1.2 菌株
    1.3 质粒
    1.4 主要试剂
    1.5 实验所需引物
    1.6 实验器材
    1.7 主要试剂配制
2 实验方法
    2.1 质粒准备
    2.2 细胞培养
    2.3 WesternBlot检测SMYD3蛋白在HEK293T细胞和Bel-7402细胞中的表达
    2.4 CRISPR/Cas9打靶载体的构建与验证
    2.5 优化脂质体最佳负载量
    2.6 嘌呤霉素对HEK293T细胞和Bel-7402细胞最低致死浓度筛选
    2.7 CRISPR/Cas9打靶活性检测
    2.8 Bel-7402细胞SMYD3基因缺陷型单克隆细胞株制备
    2.9 WesternBlot法检测SMYD3蛋白在单克隆细胞株的表达
    2.10 靶目的DNA片段测序验证
    2.11 SMYD3敲除后对细胞功能的影响
    2.12 统计学分析
3 结果
    3.1 PX459质粒测序结果
    3.2 sgRNA设计结果
    3.3 PX459酶切结果
    3.4 菌液PCR鉴定阳性sgRNA-PX459重组质粒
    3.5 sgRNA-PX459重组质粒测序结果
    3.6 细胞培养
    3.7 WesternBlot检测SMYD3蛋白在HEK293T细胞和Bel-7402细胞中的表达
    3.8 脂质体转染条件优化
    3.9 PCR产物分子量大小验证引物的有效性
    3.10 测序验证靶位点PCR引物
    3.11 打靶载体活性检测
    3.12 WesternBlot检测SMYD3蛋白表达
    3.13 筛选SMYD3基因缺陷性Bel-7402细胞株
    3.14 cck-8法检测细胞增殖
    3.15 划痕实验检测细胞迁移
4 讨论
5 结论
参考文献
综述
    参考文献
致谢
在学期间研究成果
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景[J]. 谢科,饶力群,李红伟,安学丽,方才臣,万向元.  中国生物工程杂志. 2013(06)
[2]shRNA干扰SMYD3对肝癌细胞c-Myc表达及凋亡的影响[J]. 刘鑫,陈立波,叶进,江军,何军,徐鋆耀,钱伟.  世界华人消化杂志. 2008(13)
[3]Silencing SMYD3 in hepatoma demethylates RIZI promoter induces apoptosis and inhibits cell proliferation and migration[J]. Li-Bo Chen, Jun-Yao Xu, Zhen Yang, Guo-Bin Wang Li-Bo Chen, Guo-Bin Wang, Hepatobiliary center, Union Hospital of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430022, Hubei province, China Jun-Yao Xu, Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Sun Yat-seu University, Guangzhou 510120, Guangdong province, China Zhen Yang, Department of integrated surgery, Tongji Hospital of Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2007(43)



本文编号：3198136