Dietzia菌随机插入突变体文库的构建及功能基因的筛选
发布时间：2021-05-21 02:24
石油从开采到最终使用的各个环节中导致的石油泄漏已造成严重的环境污染,微生物修复技术是治理石油环境污染最有前景的方法,掌握菌株的烷烃降解机理,是后期构建基因工程菌及利用该技术的关键。Dietzia属菌具有广谱的烃类降解能力和良好的高盐、高碱耐受能力,已成为研究放线菌烷烃降解的模式菌株。本研究以大庆油田分离的Dietzia sp.DQ12-45-1b为研究菌株,利用双质粒系统pTip-ist AB-sacB和pRTSK-sacB,构建了库容为30,720的随机突变体文库。随机挑选的突变克隆及突变克隆传代20次后的Southern blot结果表明:转座序列插入的随机性较好、均为单插入突变,并且该突变文库具有较好的遗传稳定性,可用于长期筛选功能基因。我们设计了高通量的正十六烷降解利用基因筛选方法,经过固体培养基初筛、固体培养基复筛、液体培养基复筛多重筛选,成功筛出Dietzia sp.DQ12-45-1b的七个降解利用正十六烷相关功能基因:Contig3-orf00026（编码DUF4263结构蛋白）、Contig8-orf00015（编码假定蛋白）、Contig8-orf00068（编码铁...
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 石油污染及治理技术
1.1.1 石油污染
1.1.2 石油污染修复方法
1.2 微生物感应、吸收、降解石油烃研究进展
1.2.1 微生物对石油烃的感应机制
1.2.2 微生物对石油烃的吸收途径
1.2.3 石油烃的微生物好氧降解途径
1.2.4 烷烃的厌氧微生物降解途径
1.3 影响微生物降解石油的因素
1.3.1 石油烃的组成及浓度
1.3.2 环境的温度、pH值及盐度
1.3.3 微生物自身的特点
1.4 迪茨氏属菌的研究进展
1.4.1 迪茨氏属菌的特征
1.4.3 迪茨氏菌属菌生物修复
1.5 构建、筛选突变体文库
1.6 研究目的、内容与技术路线
1.6.1 研究目的
1.6.2 研究内容
1.6.3 研究路线
第二章 材料与方法
2.1 菌株与质粒
2.2 仪器、试剂与引物
2.2.1 仪器
2.2.2 试剂
2.2.3 引物
2.3 培养基
2.4 DQ12-45-1B随机突变体文库的构建
2.4.1 DQ12-45-1b感受态细胞的制备
2.4.2 DQ12-45-1b基因组DNA的提取
2.4.3 双质粒转化DQ12-45-1b感受态细胞
2.4.4 DQ12-45-1b随机突变体文库的构建
2.4.5 Southern blot杂交方法
2.4.6 突变体插入位点随机性、插入拷贝数及传代稳定性的检测
2.5 DQ12-45-1b随机突变体文库的筛选
2.5.1 正十六烷降解利用基因的筛选与鉴定
2.5.2 突变位点检测
2.6 敲除菌株的构建
2.6.1 基因敲除步骤
2.6.2 质粒转化
2.6.3 菌液抗性复苏
2.6.4 敲除菌株的验证
2.7 回补菌株的构建
2.8 本章小结
第三章 结果与讨论
3.1 DQ12-45-1b随机突变体文库的构建
3.1.1 DQ12-45-1b随机突变体文库的构建
3.1.2 突变体文库的构建质量
3.2 正十六烷降解利用基因的筛选
3.2.1 固体培养基上正十六烷滴加量的梯度实验
3.2.2 正十六烷降解利用基因的固体培养基初筛
3.2.3 正十六烷降解利用基因的固体培养基复筛
3.2.4 正十六烷降解利用基因的液体培养基复筛
3.2.5 目的突变株的Southern blot结果
3.2.6 突变位点检测
3.2.7 目的突变株的插入位点鉴定分析
3.3 目的基因的敲除验证
3.4 基因Contig8-orf00068、Contig8-orf00071、Contig8-orf00074的回补验证
3.5 本章小结
第四章 主要结论与展望
4.1 主要结论
4.2 展望
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
本文编号：3198868
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
致谢
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 石油污染及治理技术
1.1.1 石油污染
1.1.2 石油污染修复方法
1.2 微生物感应、吸收、降解石油烃研究进展
1.2.1 微生物对石油烃的感应机制
1.2.2 微生物对石油烃的吸收途径
1.2.3 石油烃的微生物好氧降解途径
1.2.4 烷烃的厌氧微生物降解途径
1.3 影响微生物降解石油的因素
1.3.1 石油烃的组成及浓度
1.3.2 环境的温度、pH值及盐度
1.3.3 微生物自身的特点
1.4 迪茨氏属菌的研究进展
1.4.1 迪茨氏属菌的特征
1.4.3 迪茨氏菌属菌生物修复
1.5 构建、筛选突变体文库
1.6 研究目的、内容与技术路线
1.6.1 研究目的
1.6.2 研究内容
1.6.3 研究路线
第二章 材料与方法
2.1 菌株与质粒
2.2 仪器、试剂与引物
2.2.1 仪器
2.2.2 试剂
2.2.3 引物
2.3 培养基
2.4 DQ12-45-1B随机突变体文库的构建
2.4.1 DQ12-45-1b感受态细胞的制备
2.4.2 DQ12-45-1b基因组DNA的提取
2.4.3 双质粒转化DQ12-45-1b感受态细胞
2.4.4 DQ12-45-1b随机突变体文库的构建
2.4.5 Southern blot杂交方法
2.4.6 突变体插入位点随机性、插入拷贝数及传代稳定性的检测
2.5 DQ12-45-1b随机突变体文库的筛选
2.5.1 正十六烷降解利用基因的筛选与鉴定
2.5.2 突变位点检测
2.6 敲除菌株的构建
2.6.1 基因敲除步骤
2.6.2 质粒转化
2.6.3 菌液抗性复苏
2.6.4 敲除菌株的验证
2.7 回补菌株的构建
2.8 本章小结
第三章 结果与讨论
3.1 DQ12-45-1b随机突变体文库的构建
3.1.1 DQ12-45-1b随机突变体文库的构建
3.1.2 突变体文库的构建质量
3.2 正十六烷降解利用基因的筛选
3.2.1 固体培养基上正十六烷滴加量的梯度实验
3.2.2 正十六烷降解利用基因的固体培养基初筛
3.2.3 正十六烷降解利用基因的固体培养基复筛
3.2.4 正十六烷降解利用基因的液体培养基复筛
3.2.5 目的突变株的Southern blot结果
3.2.6 突变位点检测
3.2.7 目的突变株的插入位点鉴定分析
3.3 目的基因的敲除验证
3.4 基因Contig8-orf00068、Contig8-orf00071、Contig8-orf00074的回补验证
3.5 本章小结
第四章 主要结论与展望
4.1 主要结论
4.2 展望
参考文献
攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况
本文编号：3198868
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