利用CRISPR/Cas9技术编辑马铃薯StCRK1/2基因体系的初步建立

发布时间：2021-05-24 12:00

　　马铃薯是世界第三大、中国第四大粮食作物,我国已把马铃薯列为主粮提出了21世纪马铃薯主粮化战略,马铃薯单产总体呈缓慢上升趋势,但种种病害在马铃薯种植过程中影响其生长发育,最终影响马铃薯产量和品质。植物在长期进化的过程中,对各种病害发展出自己的防御机制。类受体激酶是一种可以调节植物生长发育并适应胁迫的信号分子,其中富含半胱氨酸的类受体激酶（CRK）在植物抗病和细胞程序性死亡过程中起到重要的作用。目前对CRK基因功能的研究主要集中于水稻、小麦、拟南芥、番茄等植物中,马铃薯中的报道相对较少。本实验将pMDI35S:GFP双元表达载体转化农杆菌,通过农杆菌介导法侵染马铃薯底西芮外植体,获得4个GFP转基因马铃薯品系,利用RT-qPCR筛选GFP表达量最高的品系。利用CRISPR/Cas9技术,构建了编辑GFP基因的两个载体。分析马铃薯中StCRK1和StCRK2的CDS序列,预测靶位点,构建了编辑StCRK1基因的两个载体及StCRK2基因的一个载体,为后续马铃薯StCRK1/2基因功能的研究奠定基础。 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 植物免疫系统
        1.1.1 初级免疫系统
        1.1.2 次级免疫系统
        1.1.3 系统获得抗性
    1.2 植物类受体激酶
    1.3 富含半胱氨酸的植物类受体激酶
        1.3.1 富含半胱氨酸的植物类受体激酶的结构
        1.3.2 富含半胱氨酸的植物类受体激酶的功能
    1.4 基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术
        1.4.1 基因编辑技术
        1.4.2 CRISPR/Cas9系统的发展
        1.4.3 CRISPR/Cas系统的结构和功能
        1.4.4 CRISPR/Cas系统的分类
        1.4.5 CRISPR/Cas9系统的应用
            1.4.5.1 CRISPR/Cas9系统在动物中的应用
            1.4.5.2 CRISPR/Cas9系统在植物中的应用
            1.4.5.3 CRISPR/Cas9系统在马铃薯中的应用
    1.5 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料及试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 相关试剂及药品
        2.1.4 培养基的配制
        2.1.5 相关溶液的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 DH10B大肠杆菌电转化感受态细胞制备
            2.2.1.1 准备实验
            2.2.1.2 大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备
            2.2.1.3 质粒电转化大肠杆菌DH10B感受态
        2.2.2 质粒的提取
        2.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑载体构建
            2.2.3.1 靶点选择
            2.2.3.2 sgRNA cassette构建
            2.2.3.3 pCAMBIA1300-pYAO:Cas9双元载体构建
        2.2.4 转基因马铃薯的获得及鉴定
            2.2.4.1 农杆菌的制备
            2.2.4.2 农杆菌介导马铃薯的转化
            2.2.4.3 转基因植株的鉴定
3 实验结果与分析
    3.1 农杆菌介导的GFP基因转化马铃薯
        3.1.1 pMDI35S:GFP质粒转化马铃薯
        3.1.2 转基因植株的鉴定
            3.1.2.1 基因组水平检测转基因马铃薯GFP基因
            3.1.2.2 转基因马铃薯GFP基因表达量检测
    3.2 利用CRISPR/Cas9系统编辑GFP基因
        3.2.1 靶点的选择及引物设计
        3.2.2 sgRNA cassette构建
        3.2.3 双元载体的构建
        3.2.4 GFP编辑载体转化马铃薯
    3.3 利用CRISPR/Cas9系统编辑马铃薯StCRK1/2基因载体的构建
        3.3.1 靶点的选择及引物设计
        3.3.2 sgRNA cassette构建
        3.3.3 双元载体的构建
4 结论与讨论
    4.1 结论
    4.2 讨论
        4.2.1 CRISPR/Cas9系统的应用及存在的问题
        4.2.2 本研究中存在的问题及原因分析
致谢
参考文献
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J]. 刘耀光,李构思,张雅玲,陈乐天.  华南农业大学学报. 2019(05)
[2]中国马铃薯主食产业化发展现状与前景展望[J]. 尚晋伊,史小峰.  科技资讯. 2018(21)
[3]新型基因编辑技术发展及在植物育种中的应用[J]. 王艳芳,苏婉玉,曹绍玉,张琳,吕霞,张应华,许俊强.  西北农业学报. 2018(05)
[4]马铃薯病害及其防治[J]. 孙红敏.  农民致富之友. 2017(16)
[5]利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术定向敲除烟草eIF4E-6基因[J]. 潘洪杏,刘侠,万秀清,乔婵,宋琳娜,郭兆奎,李若.  分子植物育种. 2017(02)
[6]应用TALEN技术定点突变水稻苯达松抗性基因CYP81A6[J]. 姜明君,常振仪,卢嘉威,刘东风,谢刚,陈竹锋,唐晓艳.  农业生物技术学报. 2016(08)
[7]基因组编辑技术在植物基因功能鉴定及作物育种中的应用[J]. 周想春,邢永忠.  遗传. 2016(03)
[8]CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展[J]. 刘志国.  畜牧兽医学报. 2014(10)
[9]植物抗病机制与信号传导研究进展[J]. 李智强,戴良英,刘雄伦,王国梁.  作物研究. 2011(05)
[10]锌指核酸酶在基因组靶向修饰中的应用[J]. 王令,张存芳,张智英.  中国生物化学与分子生物学报. 2009(07)



本文编号：3204159