稻瘟病新抗性基因Pi39的功能研究

发布时间：2021-05-26 12:36

　　水稻是重要的粮食作物,稻瘟病是影响水稻产量的三大病害之首,严重影响水稻产量。研究稻瘟病抗性基因,进行抗病育种是目前防治稻瘟病最经济有效的方法。由于稻瘟病菌种的变异和多样性,抗性品种在种植几年后往往会失去对稻瘟病的抗性,因此挖掘新的抗性基因至关重要。稻瘟病新抗性基因Pi39来源于云南当地品种Q15,经抗谱检测具有广谱抗性,前期已经构建了Pi39的物理图谱,并构建了10个候选基因的功能互补载体,同时进行遗传转化,得到转基因植株,本研究主要是克隆了另2个候选基因并进行遗传转化,然后对所有候选基因的转基因植株进行了分子鉴定和稻瘟病抗性鉴定,主要内容如下:（1）利用长片段PCR扩增和平末端连接的方法,构建了1300-Pi39C和1300-Pi39E功能互补载体,并进行水稻遗传转化,得到转基因植株,通过阳性鉴定获得转基因阳性植株,其中Pi39C已获得18株转基因阳性苗,Pi39E已获得44株转基因阳性苗。（2）对12个候选基因的功能互补的转基因T₁代植株进行阳性鉴定,得到阳性苗,分别进行离体接种和活体接种,观察表型,筛选出候选基因Pi39E₁即为抗性基因... 

【文章来源】：中南民族大学湖北省

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 稻瘟病抗性基因研究意义
    1.2 稻瘟病抗性基因定位与克隆
    1.3 稻瘟病抗性机理
    1.4 研究内容及意义
第二章 Pi39候选基因1300-Pi39C和1300-Pi39E的克隆及遗传转化
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 水稻品种
        2.2.2 菌株
        2.2.3 载体
        2.2.4 质粒
        2.2.5 试剂及配方
            2.2.5.1 实验试剂
            2.2.5.2 主要培养基及配方
        2.2.6 仪器设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 1300-Pi39C载体构建
            2.3.1.1 候选基因扩增引物
            2.3.1.2 Pi39C基因的扩增
            2.3.1.3 目的片段的酶切及回收
            2.3.1.4 pCAMBIA1300AscI和pCAMBIA1301 载体质粒DNA的制备
            2.3.1.5 载体质粒的酶切及去磷酸化
            2.3.1.6 目的片段与载体的连接
            2.3.1.7 连接产物热击转化Top10感受态细胞
            2.3.1.8 阳性克隆的鉴定
        2.3.2 候选基因阳性克隆电击转化农杆菌
        2.3.3 农杆菌介导的Pi39E和Pi39C水稻遗传转化
            2.3.3.1 水稻愈伤组织的诱导
            2.3.3.2 水稻愈伤组织的预培养
            2.3.3.3 农杆菌的活化
            2.3.3.4 愈伤组织侵染及共培养
            2.3.3.5 愈伤组织的筛选
            2.3.3.6 愈伤组织的分化
            2.3.3.7 幼苗的生根及移栽
        2.3.4 转基因T_0代植株的阳性鉴定
            2.3.4.1 转基因苗基因组DNA的提取
            2.3.4.2 转基因植株阳性鉴定
    2.4 实验结果
        2.4.1 Pi39C目的片段的扩增和Pi39E目的片段的酶切及回收
        2.4.2 pCAMBIA1300AscI和pCAMBIA1301载体质粒DNA的酶切及去磷酸化
        2.4.3 单克隆菌落PCR检测
        2.4.4 单克隆质粒DNA酶切检测
        2.4.5 1300-Pi39E和1300-Pi39C的遗传转化
        2.4.6 Pi39C转基因植株T_0代阳性鉴定
        2.4.7 Pi39E转基因植株T_0代阳性鉴定
    2.5 讨论
第三章 Pi39候选基因功能互补转基因植株的分子鉴定与抗病性分析
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 水稻品种和稻瘟病菌种
        3.2.2 主要试剂
        3.2.3 主要仪器设备
        3.2.4 引物与PCR程序
    3.3 实验方法
        3.3.1 材料的准备
            3.3.1.1 水稻品种
            3.3.1.2 水稻幼苗的栽培
            3.3.1.3 候选基因功能互补T_1代转基因幼苗的阳性鉴定
                3.3.1.3.1 幼苗基因组DNA的提取
                3.3.1.3.2 幼苗阳性鉴定
        3.3.2 稻瘟病菌离体接种
            3.3.2.1 稻瘟病菌的活化及产孢
            3.3.2.2 水稻叶片的处理
            3.3.2.3 离体接种
        3.3.3 稻瘟病菌活体接种
            3.3.3.1 稻瘟病菌的活化及产孢
            3.3.3.2 活体接种
    3.4 实验结果
        3.4.1 候选基因功能互补T_1代转基因幼苗的阳性鉴定
            3.4.1.1 Pi39A转基因植株T_1代阳性鉴定
            3.4.1.2 Pi39B转基因植株T_1代阳性鉴定
            3.4.1.3 其他几个候选基因植株T_1代阳性鉴定
        3.4.2 候选基因功能互补转基因植株离体接种
        3.4.3 候选基因功能互补转基因植株活体接种
    3.5 讨论
第四章 Pi39E_1RNAi载体的构建及遗传转化
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验试剂及培养基
            4.2.2.1 主要试剂
            4.2.2.2 主要培养基及配方
    4.3 实验方法
        4.3.1 植物干涉表达载体构建
            4.3.1.1 水稻Q15叶片总RNA的提取
            4.3.1.2 合成Q15 cDNA第一链
            4.3.1.3 Q15 cDNA actin检测
            4.3.1.4 Pi39E_1RNAi表达载体构建
                4.3.1.4.1 Pi39E_1RNAi目的片段的扩增
                4.3.1.4.2 Pi39E_1RNAi目的片段和空载ds1301双酶切及回收
                4.3.1.4.3 酶切产物的连接及转化
                4.3.1.4.4 第一链插入的中间载体阳性克隆鉴定
                4.3.1.4.5 第二链和中间载体双酶切及回收
                4.3.1.4.6 第二链连接中间载体及转化
                4.3.1.4.7 Pi39E_1-ds1301重组质粒双酶切鉴定
        4.3.2 Pi39E_1RNAi表达载体转入农杆菌
        4.3.3 Pi39E_1RNAi载体的遗传转化
        4.3.4 Pi39E_1RNAi转基因植株T_0代阳性鉴定
    4.4 实验结果
        4.4.1 Q15 cDNA actin检测
        4.4.2 Pi39E_1RNAi目的片段的扩增
        4.4.3 ds1301载体质粒DNA的BamH I和Asc I双酶切检测
        4.4.4 中间载体单克隆菌落PCR检测
        4.4.5 中间载体单克隆质粒DNA酶切检测
        4.4.6 Pi39E_1RNAi单克隆菌落PCR检测
        4.4.7 Pi39E_1RNAi单克隆质粒DNA酶切检测
        4.4.8 Pi39E_1RNAi单克隆农杆菌菌落PCR检测
        4.4.9 Pi39E_1RNAi的遗传转化
    4.5 讨论
第五章 Pi39E_1的表达量分析
    5.1 前言
    5.2 实验材料
        5.2.1 水稻种子和稻瘟病菌
        5.2.2 主要仪器设备
        5.2.3 主要试剂
    5.3 实验方法
        5.3.1 日本晴和Q15种子的无菌发芽
        5.3.2 日本晴和Q15叶片的离体接种
        5.3.3 RNA的提取、反转录和actin检测
        5.3.4 接种后不同时期Pi39E_1基因的表达量检测
    5.4 实验结果
        5.4.1 cDNA质量检测
        5.4.2 接种稻瘟病菌后不同时期Pi39E_1基因的表达量检测
    5.5 讨论
第六章 Pi39E_1亚细胞定位的研究
    6.1 前言
    6.2 实验材料、试剂及仪器
        6.2.1 实验材料
        6.2.2 实验试剂
            6.2.2.1 相关试剂
            6.2.2.2 水稻黄化苗培养基
        6.2.3 实验仪器
    6.3 实验方法
        6.3.1 pM999-Pi39E_1-GFP亚细胞定位载体的构建
            6.3.1.1 pM999-Pi39E_1-GFP亚细胞载体扩增引物
            6.3.1.2 Pi39E_1目的片段的扩增
            6.3.1.3 目的片段酶切及回收
            6.3.1.4 pM999-GFP空载体的双酶切及回收
            6.3.1.5 目的片段与载体连接
            6.3.1.6 连接产物热击转化DH5α感受态细胞
            6.3.1.7 pM999-Pi39E_1-GFP阳性克隆的鉴定
        6.3.2 水稻黄化苗原生质体的制备及转化
    6.4 实验结果
        6.4.1 Pi39E_1cDNA目的片段的扩增
        6.4.2 pM999-GFP载体DNA酶切
        6.4.3 单克隆菌落PCR检测
        6.4.4 单克隆质粒DNA酶切检测
    6.5 讨论
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文
参与的科研课题
参与的学术会议


【参考文献】：
期刊论文
[1]Identification and characterization of rice blast resistance gene Pid4 by a combination of transcriptomic profiling and genome analysis[J]. Zhixiong Chen,Wen Zhao,Xiaobo Zhu,Chengdong Zou,Junjie Yin,Mawsheng Chern,Xiaogang Zhou,Heng Ying,Xin Jiang,Yongzhen Li,Haicheng Liao,Mengping Cheng,Weitao Li,Min He,Jing Wang,Jichun Wang,Bingtian Ma,Jirui Wang,Shigui Li,Lihuang Zhu,Xuewei Chen.  Journal of Genetics and Genomics. 2018(12)
[2]稻瘟病抗病基因定位及克隆研究进展[J]. 赵家铭,张丽霞,郑文静.  辽宁农业科学. 2014(02)
[3]基于高光谱成像技术的水稻叶瘟病病害程度分级方法[J]. 郑志雄,齐龙,马旭,朱小源,汪文娟.  农业工程学报. 2013(19)
[4]抗稻瘟病主效QTL rbr2是Pib的等位基因[J]. 杨红,储昭晖,傅晶,王石平.  分子植物育种. 2008(02)
[5]稻瘟病抗性基因Pi-1连锁SSR标记的筛选和应用[J]. 陈志伟,官华忠,吴为人,周元昌,韩庆典.  福建农业大学学报. 2005(01)

博士论文
[1]基于文献计量的水稻三种主要病害研究水平的国际比较与实证分析[D]. 丁麟.中国农业科学院 2012



本文编号：3206389