油茶ABC转运蛋白基因家族的鉴定及其功能解析研究

发布时间：2021-05-26 15:33

　　油茶是我国极具食用价值和经济价值的木本油料树种。油茶属自交不亲和树种,种植时需要进行合理的品种配置。为解析油茶自交不亲和的分子机制,本实验室团队以油茶主要栽培品种‘华鑫’和‘华金’为试验材料,构建了自交和异交授粉后存在显著差异的雌蕊转录组数据库。通过转录组解析,发现ABC转运蛋白代谢途径与油茶自交不亲和紧密相关,为此,本课题开展了油茶ABC转运蛋白的基因克隆及功能研究。取得如下研究结果:1.油茶6条ABC转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析。从油茶自交和异交雌蕊转录组数据中筛选得到6条差异显著的ABC转运蛋白基因,设计6对特异性引物,扩增并克隆获得具有全长的CDS基因序列;该6个基因的全长CDS序列分别为:3381 bp、2142 bp、2172 bp、1935 bp、2166 bp、3318 bp,分别编码 1126、713、2172、644、721、1105 个氨基酸;相对分子量分别为 126.53、79.63、79.93、72.65、80.47、121.84kDa;等电点 PI 分别是 9.02、5.8、8.84、7.91、80.47、8.9;预测结果显示分别含有13、0、6、6、... 

【文章来源】：中南林业科技大学湖南省

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 绪论
    1.1 油茶简介
    1.2 ABC转运蛋白简介
        1.2.1 植物ABC转运蛋白的结构
        1.2.2 植物ABC转运蛋白的作用机制
        1.2.3 植物ABC转运蛋白的分类与功能
    1.3 植物自交不亲和反应简介
    1.4 研究目的及意义
    1.5 技术路线
2 油茶ABC基因的克隆及生物信息学分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 油茶雌蕊总RNA的制备
        2.2.2 RNA反转录成cDNA
        2.2.3 油茶ABC目的基因的筛选
        2.2.4 油茶ABC基因全长引物设计
        2.2.5 目的基因的PCR扩增
        2.2.6 PCR扩增产物的回收
        2.2.7 PCR扩增产物的连接转化
        2.2.8 阳性克隆筛选
        2.2.9 生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 油茶ABC转运蛋白家族的鉴定与分类
        2.3.2 油茶总RNA的提取
        2.3.3 油茶ABC转运蛋白候选基因的克隆
        2.3.4 油茶ABC基因的生物信息学分析
    2.4 讨论
3 油茶ABC基因的表达分析及原核表达
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 不同组织总RNA提取及荧光定量cDNA的制备
        3.2.2 实时荧光定量和原核表达引物设计
        3.2.3 qPCR基因表达分析
        3.2.4 荧光定量数据分析
        3.2.5 Pcold-TF表达载体的制备
        3.2.6 基因表达片段的克隆
        3.2.7 基因表达载体的制备
        3.2.8 原核表达载体的构建
        3.2.9 诱导表达及SDS-PAGE电泳检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 总RNA的提取
        3.3.2 qPCR特异性引物检测
        3.3.3 油茶ABC基因在不同器官中的表达
        3.3.4 原核表达载体Pcold-TF质粒提取
        3.3.5 原核表达载体的构建
        3.3.6 油茶ABCF3的原核表达分析
    3.4 讨论
4 油茶ABC基因的亚细胞定位和功能验证
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 亚细胞定位和真核表达引物设计
        4.2.2 目的片段和表达载体的制备
        4.2.3 载体的构建
        4.2.4 农杆菌转化
        4.2.5 亚细胞定位表达载体转化至烟草
        4.2.6 野生型拟南芥的种植
        4.2.7 真核表达载体转化至拟南芥
        4.2.8 转基因拟南芥的筛选
        4.2.9 转基因拟南芥的表型观察
        4.2.10 转基因植株可溶性糖含量的测定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 表达载体的构建
        4.3.2 PCR鉴定农杆菌阳性菌液
        4.3.3 油茶ABC基因的亚细胞定位
        4.3.4 转基因拟南芥的获得及阳性植株鉴定
        4.3.5 转基因拟南芥的表型分析
        4.3.6 转基因植株的可溶性糖含量分析
    4.4 讨论
5 结论、创新点与展望
    5.1 结论
    5.2 创新点
    5.3 研究展望
参考文献
附录A 常用实验药品配方
附录B 攻读硕士学位期间的主要学术成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]油茶产业发展新论[J]. 陈永忠,邓绍宏,陈隆升,马力,何宏,王湘南,彭邵锋,刘彩霞,王瑞,许彥明,张震.  南京林业大学学报(自然科学版). 2020(01)
[2]月季RhATAF1基因的克隆及表达特性分析[J]. 丁爱琴,李绍翠,刘庆超,王奎玲,李伟,刘庆华,姜新强.  植物生理学报. 2018(11)
[3]红外光谱快速测定油茶籽油中主要功能活性成分含量的模型建立与评价[J]. 吴雪辉,王泽富.  中国油脂. 2018(10)
[4]ABC转运蛋白与人类疾病[J]. 侯文韬,王亮,徐达,陈宇星,周丛照.  中国科学技术大学学报. 2018(10)
[5]梨自交不亲和性反应S-RNase新靶点——微丝骨架[J]. 吴巨友,李启明,王鹏,张绍铃.  南京农业大学学报. 2018(05)
[6]“十二五”期间我国油茶产业发展特征分析[J]. 丁松,潘鹏,张邦文,韩天一,金苏蓉,肖欣,黎芳.  福建林业科技. 2018(03)
[7]油茶种植技术措施与油茶作物发展前景[J]. 钟明顺.  农业与技术. 2018(17)
[8]油茶良种化的现状及发展对策分析[J]. 邓发生.  南方农业. 2018(26)
[9]铁皮石斛自交和杂交亲和性的细胞学研究[J]. 高杨,林韧安,袁超群,马丽娅,王佳囡,朱玉球,高燕会.  浙江农林大学学报. 2018(04)
[10]药用植物铁皮石斛ABC转运蛋白基因的鉴定及其差异表达分析[J]. 阎波,刘思思,陈娟,郭顺星.  药学学报. 2018(07)

博士论文
[1]油茶后期自交不亲和性的细胞学研究[D]. 高超.中南林业科技大学 2017
[2]茶树育性相关基因的克隆与表达研究[D]. 张成才.华中农业大学 2017
[3]基于蛋白组学的甘蓝自交不亲和性相关新基因的克隆与功能探索[D]. 曾静.西南大学 2017
[4]苹果MdABCF转运S-RNase至花粉管影响自交不亲和反应[D]. 孟冬.中国农业大学 2014
[5]烟草ABC转运蛋白家族鉴定及次生代谢物质转运的功能研究[D]. 谢小东.重庆大学 2014
[6]油茶种仁糖酵解途径解析及醛缩酶基因家族功能研究[D]. 曾艳玲.中南林业科技大学 2013
[7]油茶种子发育过程组分及脂类代谢相关基因表达变化研究[D]. 周长富.中国林业科学研究院 2013
[8]茶树自交不亲和类型的鉴定及相关基因克隆与表达分析[D]. 陈暄.南京农业大学 2010

硕士论文
[1]苦荞ABC转运蛋白基因的克隆与功能初步分析[D]. 李洁.西北农林科技大学 2018
[2]柚ABC基因的筛选、克隆及其表达研究[D]. 宋敏娜.福建农林大学 2018
[3]岷江百合LrABCF1基因的克隆及功能验证[D]. 李绍华.西北农林科技大学 2017
[4]油桐长链脂酰辅酶A合成酶基因的克隆与功能表达研究[D]. 吕佳斌.中南林业科技大学 2017
[5]光皮桦BlKNOX家族基因表达及互作机制分析[D]. 赵传慧.浙江农林大学 2014
[6]油茶自交不亲和性初步研究[D]. 廖婷.中南林业科技大学 2013
[7]湖南省油茶产业化发展策略研究[D]. 周琳.湖南农业大学 2012



本文编号：3206618