优化巴马香猪超排和利用CRISPR/Cas9技术建立PDX-1基因敲除猪的研究

发布时间：2021-06-09 03:47

　　小型猪作为模式动物由来已久,相比小鼠等模式生物,小型猪模型体重与人类相当,器官大小也与人类器官相似,而且在生理生化、解剖学和疾病发生机理等方面都与人类极为相似,许多基因在啮齿类动物模型中不具备与人体类似的生理代谢相关功能,而猪相比啮齿类模型更贴近于人,通过在猪上研究相关基因的功能可以更好的验证其功能。这些优势都使小型猪模型动物比之其他动物模型不论生物或是医学研究领域中都具有极为重要的科研和应用价值。在CRISPR/Cas系统出现之前,没有合适的胚胎干细胞系一直是限制小型猪基因敲除的主要因素,CRISPR/Cas9技术的出现从技术上打破了这一僵局极大的方便了猪基因敲除模型的建立。PDX-1基因在胰腺发育中起着重要作用,早期胚胎发育时期,胰腺的发育主要是通过背腹两侧的上皮芽进行融合从而形成胰芽。在小鼠中生产PDX-1基因敲除纯合子小鼠后发现,纯合敲除的小鼠缺乏成熟的胰腺组织,并且十二指肠的部分区域也呈现异常状态。出生后的小鼠不能存活很久,会很快死于高血糖。巴马香猪上PDX-1基因在猪并没有做过敲除研究,尚不清楚其在猪上的功能。本论文主要研究在小型猪上如何通过超数排卵获得大量优质胚胎用于胞浆... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 CRISPR/CAS系统
        1.1.1 CRISPR研究简史
        1.1.2 CRISPR/CAS系统的机制
        1.1.3 基因编辑技术在转基因猪中的应用及存在问题
    1.2 超数排卵
        1.2.1 哺乳动物卵泡形成的特点
        1.2.2 超排研究的目的和意义
        1.2.3 超排原理
        1.2.4 影响哺乳动物卵泡发生的激素
        1.2.5 影响超排效果的因素
        1.2.6 超数排卵研究进展
    1.3 PDX-1 基因的概述
        1.3.1 PDX-1 基因的结构
        1.3.2 PDX-1 基因的表达
        1.3.3 PDX-1 基因在胰腺发育中的作用
        1.3.4 PDX-1 基因缺陷猪的应用价值
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物和CRISPR/Cas9系统
        2.1.2 实验药品
        2.1.3 试验中常用试剂及配制
        2.1.4 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 实验动物的准备
        2.2.2 超排处理
        2.2.3 胚胎回收
        2.2.4 目的基因的靶向sg RNA的设计
        2.2.5 体外合成Cas9 mRNA和sgRNA
        2.2.6 胞质注射
        2.2.7 胚胎移植
        2.2.8 受体移植怀孕判断
        2.2.9 卵母细胞的获取
        2.2.10 卵母细胞体外成熟
        2.2.11 I VF体外受精
        2.2.12 孤雌胚胎获得
        2.2.13 PDX-1 基因敲除猪只的鉴定
        2.2.14 统计分析方法
3 结果
    3.1 超排剂量和排卵点数量的关系
    3.2 超排剂量和囊肿的数量的关系
    3.3 超排剂量和白体的数量的关系
    3.4 不同季节下对超排卵数的影响
    3.5 超排胚胎和体外获得的孤雌、I VF、S CNT胚胎发育的差异
    3.6 胞浆注射获得的PDX-1 缺陷猪模型的鉴定
4 讨论
    4.1 超数排卵
        4.1.1 超排激素类型对超排结果的影响
        4.1.2 超排剂量对超排结果的影响
        4.1.3 前列烯醇在超排中的作用
        4.1.4 季节因素对超排的影响
    4.2 PDX-1 基因敲除猪
        4.2.1 目的基因的选择和基因敲除动物的制备方法
        4.2.2 基因敲除动物的鉴定与检测
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3219857