基于大片段克隆技术的罗中链霉菌TRM49605次生代谢产物基因簇挖掘
发布时间：2021-06-09 02:11
放线菌具有丰富的次级代谢产物,是挖掘新型药物的重要来源。新疆典型极端盐碱环境蕴含着大量放线菌新物种,放线菌在适应高盐碱等极端环境可能演化出独特的次级代谢产物,进而引起国内外研究者的关注。本研究选择来自新疆典型极端盐碱环境罗布泊地区一株链霉菌新物种TRM49605对其进行基因簇分析,采用Red/ET重组技术对3个基因簇进行克隆和异源表达。通过异源表达,确定生物合成基因簇的生物学功能,以期获得结构新颖、活性较强的次级代谢产物,同时为后期基因改造以及组合生物学储备基因资源。（1）罗中链霉菌次级代谢潜力分析为探索罗中链霉菌（Streptomyces luozhongensis）TRM49605次级代谢潜能,本研究对其进行全基因组测序分析,结果表明罗中链霉菌基因组DNA全长7 156 507 bp,通过antiSMASH分析发现其潜在天然产物生物合成基因簇有63个。为探究不同相似性基因簇异源表达情况,评估TRM49605次级代谢潜能,选取3个代表基因簇进行分析,其中,Cluster24是一个核苷类抗生素生物合成基因簇,全长29 393 bp,由26个基因组成,与衣霉素基因簇相似性为92%;基因簇...
【文章来源】：塔里木大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于基因组挖掘新天然产物策略[45]
塔里木大学硕士学位论文第1章引言9克隆技术要求极高。链霉菌生物合成基因簇的异源表达及生物合成相应的次级代谢产物已逐渐成为发现新颖活性化合物的有效手段之一。TAR（transformationassociatedrecombination）克隆技术作为研究微生物次级代谢产物的重要工具，能够实现绝大多数基因簇的克隆及异源表达。TAR是由Natalay等人在2006年提出的大片段DNA获得方法[57,58]，其原理是基于酵母重组系统，根据克隆载体两端特异性的靶向目的基因序列从基因组中抓取目的基因簇，两端同源臂长度一般达到60bp以上就能实现目的片段的选择性捕获。TAR克隆是目前唯一能够特异性克隆300kb的大片段DNA的方法。同时，TAR载体还包含酵母着丝粒序列（CEN）和酵母选择性标记(His3)，便于阳性载体在酵母细胞中的复制和筛眩TAR在酵母强大的重组体系中表现出较高的重组效率，其主要的优点有（1）可从复杂基因组中选择性分离目标DNA；（2）重组DNA片段最长可达300kb；（3）操作简便；（4）载体特性可在酵母、大肠杆菌、放线菌中操作。TAR（transformationassociatedrecombination）克隆技术由于其独特的优势近年来被广泛应用于微生物次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达（如图1-2），下面对通过TAR克隆所得基因簇做一汇总（如表1-2）。图1-2基于TAR克隆的异源表达策略[59]Fig.1-2HeterologousexpressionstrategybasedonTARcloning
塔里木大学硕士学位论文第1章引言112008年，Gibson及其同事人工构建生殖道支原体Mycoplasmagenitalium基因组，全长580kb，实现DNA组装的巨大突破，提出一种无缝克隆方法GibsonAssembly又叫“Gibson恒温一步组装法”[67,68]。其后赵惠民[69]也开发出类似原理的组装方式-DNA装配器（DNAassembler），并成功获得D-木糖代谢途径及玉米黄质生物合成途径。Li等[70]将此方法进行修饰并应用于链霉菌等高GC含量的次级代谢产物的挖掘。通过载体与外源DNA两端相应的同源臂在体外进行重组，此技术的巧妙之处是体外重组过程中所用的DNA核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶可在同一温度50℃发挥较好的活性，但其也存在一些局限性，如很难组装小于200bp的片段，同时组装片段数目受限等，其原理如图1-3。Gibson组装非常适合用于拼接多个线性DNA片段，是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将目的基因片段定向克隆至任意载体的任意位点。将载体通过PCR方式在任意位点进行线性化，并在插入片段两端通过PCR挂载与载体末端同源的序列，使得插入片段与克隆载体具有同源序列（15bp～20bp）。然后按一定比例混合后，在DNA核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的催化下反应15min即可进行转化，完成定向克拢其后Jiang[71]等人提出进行Cas9-AssistedTargetingofCHromosomesegments（CATCH）DNA重组技术，通过Cas9蛋白切割基因组DNA获得目的基因簇，再通过GibsonAssembly克隆目的基因簇到载体，实现了目的基因簇的高效获龋图1-3Gibson组装原理Fig.3-1Gibsonassemblyprinciple
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用合成生物学技术深入挖掘放线菌中活性次级代谢产物[J]. 白超弦,卓英,张立新. 微生物学通报. 2013(10)
[2]基因组挖掘技术在海洋放线菌天然产物研究开发中的应用及展望[J]. 陈亮宇,王玉梅,赵心清. 微生物学通报. 2013(10)
[3]海洋真菌次级代谢产物化学成分及生物活性的研究进展[J]. 杨加庚,梅益勤,裴月湖. 沈阳药科大学学报. 2013(01)
[4]灰红链霉菌AL7基因组文库及异源表达文库的构建[J]. 刘培,俞燕飞,陶美凤. 华中农业大学学报. 2012(05)
[5]适用于链霉菌大片段基因组DNA克隆和异源表达的细菌人工染色体（BAC）载体的构建及应用[J]. 黄胜,李娜,周俊,何璟. 微生物学报. 2012(01)
[6]一株具有抗肿瘤活性的海洋放线菌的分离和鉴定[J]. 袁献温,杨瑞丽. 微生物学通报. 2009(01)
[7]缬氨霉素液膜传输Rb+跨人红细胞膜行为的研究[J]. 王亚妮,蒋育澄,冯云晓,胡满成,李淑妮. 化学学报. 2008(13)
[8]微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新[J]. 白林泉,邓子新. 中国抗生素杂志. 2006(02)
[9]放线菌——微生物药物的重要资源[J]. 刘志恒. 微生物学通报. 2005(06)
[10]Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用[J]. 胡堃,史兆兴,赛道建,黄留玉. 遗传. 2003(05)
博士论文
[1]基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达平台的构建与应用[D]. 李振.山东大学 2019
硕士论文
[1]两株链霉菌新物种的多相分类及其次生代谢产物研究[D]. 张仁文.塔里木大学 2016
[2]青海高原（西部）土壤放线菌资源及应用研究[D]. 司美茹.西北农林科技大学 2003
本文编号：3219699
【文章来源】：塔里木大学新疆维吾尔自治区
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于基因组挖掘新天然产物策略[45]
塔里木大学硕士学位论文第1章引言9克隆技术要求极高。链霉菌生物合成基因簇的异源表达及生物合成相应的次级代谢产物已逐渐成为发现新颖活性化合物的有效手段之一。TAR（transformationassociatedrecombination）克隆技术作为研究微生物次级代谢产物的重要工具，能够实现绝大多数基因簇的克隆及异源表达。TAR是由Natalay等人在2006年提出的大片段DNA获得方法[57,58]，其原理是基于酵母重组系统，根据克隆载体两端特异性的靶向目的基因序列从基因组中抓取目的基因簇，两端同源臂长度一般达到60bp以上就能实现目的片段的选择性捕获。TAR克隆是目前唯一能够特异性克隆300kb的大片段DNA的方法。同时，TAR载体还包含酵母着丝粒序列（CEN）和酵母选择性标记(His3)，便于阳性载体在酵母细胞中的复制和筛眩TAR在酵母强大的重组体系中表现出较高的重组效率，其主要的优点有（1）可从复杂基因组中选择性分离目标DNA；（2）重组DNA片段最长可达300kb；（3）操作简便；（4）载体特性可在酵母、大肠杆菌、放线菌中操作。TAR（transformationassociatedrecombination）克隆技术由于其独特的优势近年来被广泛应用于微生物次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达（如图1-2），下面对通过TAR克隆所得基因簇做一汇总（如表1-2）。图1-2基于TAR克隆的异源表达策略[59]Fig.1-2HeterologousexpressionstrategybasedonTARcloning
塔里木大学硕士学位论文第1章引言112008年，Gibson及其同事人工构建生殖道支原体Mycoplasmagenitalium基因组，全长580kb，实现DNA组装的巨大突破，提出一种无缝克隆方法GibsonAssembly又叫“Gibson恒温一步组装法”[67,68]。其后赵惠民[69]也开发出类似原理的组装方式-DNA装配器（DNAassembler），并成功获得D-木糖代谢途径及玉米黄质生物合成途径。Li等[70]将此方法进行修饰并应用于链霉菌等高GC含量的次级代谢产物的挖掘。通过载体与外源DNA两端相应的同源臂在体外进行重组，此技术的巧妙之处是体外重组过程中所用的DNA核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶可在同一温度50℃发挥较好的活性，但其也存在一些局限性，如很难组装小于200bp的片段，同时组装片段数目受限等，其原理如图1-3。Gibson组装非常适合用于拼接多个线性DNA片段，是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将目的基因片段定向克隆至任意载体的任意位点。将载体通过PCR方式在任意位点进行线性化，并在插入片段两端通过PCR挂载与载体末端同源的序列，使得插入片段与克隆载体具有同源序列（15bp～20bp）。然后按一定比例混合后，在DNA核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的催化下反应15min即可进行转化，完成定向克拢其后Jiang[71]等人提出进行Cas9-AssistedTargetingofCHromosomesegments（CATCH）DNA重组技术，通过Cas9蛋白切割基因组DNA获得目的基因簇，再通过GibsonAssembly克隆目的基因簇到载体，实现了目的基因簇的高效获龋图1-3Gibson组装原理Fig.3-1Gibsonassemblyprinciple
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用合成生物学技术深入挖掘放线菌中活性次级代谢产物[J]. 白超弦,卓英,张立新. 微生物学通报. 2013(10)
[2]基因组挖掘技术在海洋放线菌天然产物研究开发中的应用及展望[J]. 陈亮宇,王玉梅,赵心清. 微生物学通报. 2013(10)
[3]海洋真菌次级代谢产物化学成分及生物活性的研究进展[J]. 杨加庚,梅益勤,裴月湖. 沈阳药科大学学报. 2013(01)
[4]灰红链霉菌AL7基因组文库及异源表达文库的构建[J]. 刘培,俞燕飞,陶美凤. 华中农业大学学报. 2012(05)
[5]适用于链霉菌大片段基因组DNA克隆和异源表达的细菌人工染色体（BAC）载体的构建及应用[J]. 黄胜,李娜,周俊,何璟. 微生物学报. 2012(01)
[6]一株具有抗肿瘤活性的海洋放线菌的分离和鉴定[J]. 袁献温,杨瑞丽. 微生物学通报. 2009(01)
[7]缬氨霉素液膜传输Rb+跨人红细胞膜行为的研究[J]. 王亚妮,蒋育澄,冯云晓,胡满成,李淑妮. 化学学报. 2008(13)
[8]微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新[J]. 白林泉,邓子新. 中国抗生素杂志. 2006(02)
[9]放线菌——微生物药物的重要资源[J]. 刘志恒. 微生物学通报. 2005(06)
[10]Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用[J]. 胡堃,史兆兴,赛道建,黄留玉. 遗传. 2003(05)
博士论文
[1]基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达平台的构建与应用[D]. 李振.山东大学 2019
硕士论文
[1]两株链霉菌新物种的多相分类及其次生代谢产物研究[D]. 张仁文.塔里木大学 2016
[2]青海高原（西部）土壤放线菌资源及应用研究[D]. 司美茹.西北农林科技大学 2003
本文编号：3219699
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