CRISPR质粒和同源重组模板的共转染降低了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率
发布时间：2021-06-13 21:39
CRISPR/Cas9系统具有识别并切割特定序列DNA的功能,是广泛应用的基因编辑工具。虽然CRISPR/Cas9系统可以高效地产生基因敲除,但是精确的基因编辑的效率仍然很低,这主要是由于同源重组修复的效率很低。目前已有多个方法可以在一定程度上提高CRISPR/Cas9系统介导的同源重组的效率,例如抑制非同源末端连接修复,优化同源模板的设计等。最近有研究报道将Cas9 RNP和同源模板相继电转染进细胞提高了同源重组的效率,但是其具体机制仍不清楚。因此,本研究探讨了共转染CRISPR质粒和同源重组模板对CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率的影响以及可行的降低影响的办法。首先,我们用T7E1内切酶实验和RT-qPCR检测了只转染CRISPR质粒组以及共转染质粒和模板组细胞内Cas9的切割效率,RNA和DNA水平的差异。其次,检测了降低共转染的同源模板DNA的数量时,细胞内Cas9DNA和RNA水平的变化。然后,将GFP质粒分别和单链DNA、双链DNA共转染细胞,检测细胞内的绿色荧光强度。最后,为了验证将二者相继转染是否可以降低上述的影响,我们先转染了 CRISPR质粒后转染了同源重组模...
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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【参考文献】：
期刊论文
[1]p53 gene therapy in combination with transcatheter arterial chemoembolization for HCC:One-year follow-up[J]. Yong-Song Guan,Yuan Liu,Qing He,Xiao Li,Lin Yang,Ying Hu,Zi La,Department of Oncology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2011(16)
[2]重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗肺癌所致胸腔积液的临床研究[J]. 赵伟珠,王季堃,李巍,张秀丽. 癌症. 2009(12)
[3]重组人内皮抑素腺病毒注射液Ⅰ期临床耐受性试验[J]. 曹烨,李苏,李鸿立,李宇红,张东生,郭颖,李晓玲,林旭滨,黄文林,姜文奇. 癌症. 2007(08)
[4]Long-term modifications of blood pressure in normotensive and spontane-ously hypertensive rats by gene delivery of rAAV-mediated cytochrome P450 arachidonic acid hydroxylase[J]. Katherine CIANFLONE. Cell Research. 2005(09)
[5]Intra-tumor injection of H101,a recombinant adenovirus,in combination with chemotherapy in patients with advanced cancers:A pilot phase Ⅱ clinical trial[J]. Wei Lu Shu Zheng Xu-Feng Li Jian-Jin Huang Cancer Center,Second Affiliated Hospital,Medical College,Zhejiang University,Hangzhou 310009,Zhejiang Province,China Xiao Zheng Zhen Li Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou 310022,Zhejiang Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2004(24)
[6]基因工程腺病毒（H101）瘤内注射联合化疗治疗头颈部及食管鳞癌的Ⅲ期临床研究[J]. 夏忠军,常建华,张力,姜文奇,管忠震,刘基巍,张阳,胡晓桦,吴国华,王华庆,陈正常,陈建超,周清华,陆建伟,樊青霞,黄建瑾,郑晓. 癌症. 2004(12)
[7]An armed oncolytic adenovirus system, ZD55-gene, demonstrating potent antitumoral efficacy[J]. ZI LAI ZHANG, WEI Guo ZOU, CHUN XIA LUO, BING HUA LI, JIN HUI WANG, LAN YING SUN, QI JUN QIAN, XIN YUAN LIULaboratory of Biotechnology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China. E-mail: xyliu@sibs.ac.cn Eastern Heptobiliary Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China. Cell Research. 2003(06)
[8]瘤内注射E1B缺失腺病毒（H101）与化疗联合治疗恶性肿瘤的Ⅱ期临床试验[J]. 徐瑞华,袁中玉,管忠震,曹烨,王华庆,胡晓桦,冯继峰,张阳,李方,陈正堂,王杰军,黄建瑾,周清华,宋三泰. 癌症. 2003(12)
[9]IMPLANTATION OF AUTOLOGOUS SKIN FIBROBLAST GENETICALLY MODIFIED TO SECRETE CLOTTING FACTOR IX PARTIALLY CORRECTS THE HEMORRHA[J]. 邱信芳,卢大儒,周洁民,王健民,杨建民,孟沛霖,薛京伦. Chinese Medical Journal. 1996(11)
本文编号：3228388
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２?ＣＲＩＳＰＲ质粒和同源重组修复模板共转染降低了细胞内Ｃａｓ９的表达水平和ＤＮＡ含量??Ａ．实时定量ＰＣＲ检测细胞内Ｃａｓ９的表达水平
??染ＣＲＩＳＰＲ质粒组的差距显著缩小（图３Ｂ）。这些都与细胞内Ｃａｓ９的ＤＮＡ水平的??变化基本一致。虽然共转染ｄｓＤＮＡ模板的细胞内Ｃａｓ９的ＲＮＡ水平也在模板数量??为１?ｐｍｏｌ时显著提高，但是仍与只转染ＣＲＩＳＰＲ质粒组的细胞内的Ｃａｓ９表达水平??有明显差距（图３Ｂ）。??Ａ??１０ｈ?２４ｈ??＊＊??＜?１５１?二?＊＊＊＊?１?＊＊＊＊?＜?１５－，??Ｚ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?１??Ｑ?Ｔ?ｑ??ｗ?支?打?－１??０?１０－ｉ?Ｔ?ｆ?■＊＊＊＊?Ｉ?、一?，?ｒ?，??２；?〇．〇ｉＵ?１?臟??Ｓ?〇．〇］！■?■?＿???Ｔ２：?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋＋?Ｔ２：?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋?＋??Ｄｏｎｏｒ：?＿?１０?５?１?１０?５?１?１０?５?１?ｐｍｏｌ?Ｄｏｎｏｒ：?一?ｉ〇?５?１?１０?５?１?１０?５?１?ｐｍｏｌ??ｓｔ?ｓｎ?ｄｓ?ｓｔ?ｓｎ?ｄｓ??Ｂ??２４ｈ?４８ｈ??＜?１－５ｉ?＜?１－５ｉ?
??并在Ｔ２质粒切割位点附近设计了四条相同长度的ｓｓＤＮＡ?（图４Ａ），通过退火形成??了?２４ｂｐ，１６ｂｐ和８ｂｐ三种不同互补长度的ｄｓＤＮＡ。??通过将ＰＥＧＦＰ－Ｎ２质粒与ｓｓＤＮＡ或三种不同互补长度的ｄｓＤＮＡ共转染，我们??发现共转染质粒和ｄｓＤＮＡ的细胞内ＧＦＰ的荧光强度均低于共转染质粒和ｓｓＤＮＡ??的细胞，其中转染了完全互补的ｄｓＤＮＡ的细胞内ＧＦＰ荧光强度最弱，而随着ｄｓＤＮＡ??的互补长度的缩短，即单链区域长度的增加，细胞内ＧＦＰ荧光强度逐渐增强（图??４Ｂ）。??Ａ???ｓｓＤＮＡ?（ｓ）??５’?－?ＡＧＧＣＣＴＡＡＧＧＡＴ６ｅ６ＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＣＡｆＤＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡｅＴＧｅＣＣＣＣ／？）ｃＴ６ＴＧＧＧＧＴＧｅＡ６Ｇ６?－３ｒ??．（＞?＞?■．?．?＜－■?Ｉ?＜?＾?＞?＞?－ｈＴＴ?？?Ｉ?？？?．?．?ｉ?．?．?■?Ｉ?Ｉ?■?■?■?ｕ?■?Ｔ７ＴＩ?．?Ｉ?■?．?）?．?■?Ｉ?■?Ｉ?■?＞?■?＞??３，?－?ＴＣＣＧＧＡＴＴＣＣＴ＾ＣＣＣＣＧＡＡｌＡＡＧＡＣＡＧｆＧＧＴＴＡＧＧ／＾ＣＡＧＧＧＡＴＣｊＡＣＣＧＧＧＧＴｌＧＡＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣ?＿?５＊??ｓｓＤＮＡ?（ａ２）?ｓｓＤＮＡ?（ａ”?ｓｓＤＮＡ?（ａ）??Ｂ??ｓｓＤＮＡ（ｓ）?ｓｓＤＮＡ（ａ）?ｓｓＤＮＡ（ａｌ）?ｓｓＤＮＡ（ａ２）??＿＿＿＿??ｄｓＤＮＡ（ｓ＋ａ）?ｄｓＤＮＡ（ｓ＋ａ１）?ｄｓＤＮＡ（ｓ＋ａ２）??ｈＢＩＨＥＢＢＳｈ??图４?ＤＮＡ的双链互补片段降低了共转染的质粒的转染效率??Ａ．?位点内不同互补长度的ｓｓＤＮＡ设计图。ｓｓＤＮＡ（ｓ）
【参考文献】：
期刊论文
[1]p53 gene therapy in combination with transcatheter arterial chemoembolization for HCC:One-year follow-up[J]. Yong-Song Guan,Yuan Liu,Qing He,Xiao Li,Lin Yang,Ying Hu,Zi La,Department of Oncology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,Sichuan Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2011(16)
[2]重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗肺癌所致胸腔积液的临床研究[J]. 赵伟珠,王季堃,李巍,张秀丽. 癌症. 2009(12)
[3]重组人内皮抑素腺病毒注射液Ⅰ期临床耐受性试验[J]. 曹烨,李苏,李鸿立,李宇红,张东生,郭颖,李晓玲,林旭滨,黄文林,姜文奇. 癌症. 2007(08)
[4]Long-term modifications of blood pressure in normotensive and spontane-ously hypertensive rats by gene delivery of rAAV-mediated cytochrome P450 arachidonic acid hydroxylase[J]. Katherine CIANFLONE. Cell Research. 2005(09)
[5]Intra-tumor injection of H101,a recombinant adenovirus,in combination with chemotherapy in patients with advanced cancers:A pilot phase Ⅱ clinical trial[J]. Wei Lu Shu Zheng Xu-Feng Li Jian-Jin Huang Cancer Center,Second Affiliated Hospital,Medical College,Zhejiang University,Hangzhou 310009,Zhejiang Province,China Xiao Zheng Zhen Li Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou 310022,Zhejiang Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2004(24)
[6]基因工程腺病毒（H101）瘤内注射联合化疗治疗头颈部及食管鳞癌的Ⅲ期临床研究[J]. 夏忠军,常建华,张力,姜文奇,管忠震,刘基巍,张阳,胡晓桦,吴国华,王华庆,陈正常,陈建超,周清华,陆建伟,樊青霞,黄建瑾,郑晓. 癌症. 2004(12)
[7]An armed oncolytic adenovirus system, ZD55-gene, demonstrating potent antitumoral efficacy[J]. ZI LAI ZHANG, WEI Guo ZOU, CHUN XIA LUO, BING HUA LI, JIN HUI WANG, LAN YING SUN, QI JUN QIAN, XIN YUAN LIULaboratory of Biotechnology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China. E-mail: xyliu@sibs.ac.cn Eastern Heptobiliary Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China. Cell Research. 2003(06)
[8]瘤内注射E1B缺失腺病毒（H101）与化疗联合治疗恶性肿瘤的Ⅱ期临床试验[J]. 徐瑞华,袁中玉,管忠震,曹烨,王华庆,胡晓桦,冯继峰,张阳,李方,陈正堂,王杰军,黄建瑾,周清华,宋三泰. 癌症. 2003(12)
[9]IMPLANTATION OF AUTOLOGOUS SKIN FIBROBLAST GENETICALLY MODIFIED TO SECRETE CLOTTING FACTOR IX PARTIALLY CORRECTS THE HEMORRHA[J]. 邱信芳,卢大儒,周洁民,王健民,杨建民,孟沛霖,薛京伦. Chinese Medical Journal. 1996(11)
本文编号：3228388
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