蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

发布时间：2021-06-19 16:34

　　作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用,具有无耐药性、无残留等特点,被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素,改善滥用抗生素所引起的一系列问题,市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势,由于目前生产的菌株表达量偏低,限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量,根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化,并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL,经遗传霉素G418抗性筛选后,获得了一株酵母转化子（G-pcoEWL）,其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h,实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中,总蛋白浓度为607 mg·L-1,酶活达到677 U·mL-1。此外,本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到Sephadex G-50的分离效果更好,并在14.4 kDa处得... 

【文章来源】：浙江大学学报(理学版). 2020,47(04)北大核心CSCD

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【图文】：

重组表达载体pPIC9K-coEWL的构建

通过设计与毕赤酵母表达载体pPIC9K具有同源区段的引物，以优化后的合成基因片段为模板，通过高保真PCR扩增出带同源臂的coEWL基因的ORF区段，获得422 bp目的基因片段，其琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。采用无缝克隆技术连接至酶切后pPIC9K线性空载体，构建真核表达载体pPIC9K-coEWL。将重组质粒转至大肠杆菌BL21感受态细胞后，筛选出阳性转化子并抽提质粒，经BamHI、Sal I双酶切后，得到2 614 bp和7 037 bp目的基因片段，结果如图4所示。测序结果显示重组质粒pPIC9K-coEWL构建正确。图3 coEWL PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

coEWL PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图

【参考文献】：
期刊论文
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[3]外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略[J]. 孙玮遥,王向东,林剑.  中国酿造. 2016(09)
[4]巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达研究[J]. 孔萌萌,孙江华.  轻工科技. 2015(12)
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[10]人骨形态发生蛋白4多拷贝表达盒的构建及其表达[J]. 黄义德,吴金芸,徐轶彦,韩明,林政.  福建师范大学学报(自然科学版). 2011(06)

博士论文
[1]猪溶菌酶的重组表达及其增效研究[D]. 朱德伟.江南大学 2017

硕士论文
[1]海参i-型溶菌酶基因的优化及在毕赤酵母中表达和发酵[D]. 张洋.大连工业大学 2016



本文编号：3238160