Bacillus cereus中羰基还原酶的基因挖掘及克隆表达研究

发布时间：2021-06-24 06:24

　　手性醇是工业合成药物、农用化学品、天然产品及某些特殊材料过程中一种重要的手性砌块。利用羰基还原酶不对称还原前手性羰基化合物,是合成手性醇的重要方法之一。本文通过构建基因挖掘策略,挖掘蛋白质数据库中潜在羰基还原酶,并进行了克隆表达研究。本研究在确定羰基还原酶各家族的氨基酸保守序列后,选取来源于极端嗜热菌Aeropyrum pernix K1中的羰基还原酶（ApCR）,作为探针酶。以探针酶的氨基酸序列为模板,在蛋白质数据库中进行同源序列比对、筛选后,构建候选酶库。通过对候选酶序列和探针序列进行氨基酸序列比对、二级结构模拟比对、三级结构模拟比对后,确定来源于蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus中的蛋白BcCR,与探针ApCR序列具有相似的二级、三级结构,并且都具有羰基还原酶SDRs家族的氨基酸保守序列,推测该蛋白具有与ApCR相似的酶学性质及功能。以B.cereus的基因组DNA为模板,PCR克隆出BcCR基因（738bp）,构建重组质粒pET 28a-BcCR,并将其导入在E.coli B121（DE3）plysS中,实现了可溶性表达,蛋白大小约为32kDa。对表达出的目标酶进行酶学性... 

【文章来源】：武汉科技大学湖北省

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．１辅酶ＮＴＡＤ（Ｐ）Ｈ氢转移示意图??Ｆｉｇ．?１．１?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｈｙｄｒｏｇｅｎ?ｔｒａｎｓｆｅｒ?ｆｏｒｍ?ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ?ｔｏ?ｔｈｅ?ｃａｒｂｏｎ??

２．２．２基因挖掘原理??基因挖掘的原理，主要是针对某种特定的生物或整个公共数据库，对已知的??基因或蛋白质序列进行检索、分析、筛选，最终获得目标蛋白，流程如图２．１所??１３??

＿３８４９），与探针酶ＡｐＣＲ的氨基酸序列一致性为３８．４％。氨基酸??序列比对结果见图２．４，分析可见二者均包含了?ＳＤＲ家族的活性中心保守区??Ｙ－Ｘ３－Ｋ，辅因子结合位点保守区ＴＧ－Ｘ３－Ｇ－Ｘ－Ｇ。ＢｃＣＲ与ＡｐＣＲ的二级结构模??拟见图２．５，由图可见，二者的二级结构，在的ａ螺旋、（３折叠、无规则卷曲所??在的氨基酸位置及分布区间相似。ＢｃＣＲ与ＡｐＣＲ的三级结构模拟见图２．６，可??见二者的三级结构也很相似。??首先，根据ＢｃＣＲ具有羰基还原酶的催化位点和辅酶结合位点的氨基酸保守??序列，初步推测其具有羰基还原酶活性。然后，根据ＢｃＣＲ与ＡｐＣＲ具有相似的??二级和三级结构，初步推测二者具有相似酶学性质。即ＢｃＣＲ为ＳＤＲｓ家族的羰??基还原酶，能催化ＣＯＢＥ还原为相应的手性醇，并需要ＮＡＤＰＨ的参与，同时，??该酶可能具有耐高温和热稳定性较好的特性。??ＡｐＣＲ．ｓｅｑ?．?ＭＥＴ?Ｔ?Ｌ?Ｒ?Ｅｇｌｖ?ｆｇｇ?Ｉ?Ｋ?Ｓ?ＲＡＤ?３９??３ｃＣＲ．ｓｅｑ?邏?４０??Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?ａｌｌｔｇ?ｓｒｇＴｇｆａ?ａ?９?ｖｖ?ｙ??Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?ａ?ｅ?Ｘｇｓ?ａ?ｖｒ?ｄｖ?ｄ?ｖｚ?ｍ??ＡｐＣＲ．ｓｅｑ?ＩＦＨｌＮ＼ｇｇｊｇｇｊｌ－ＱＬＧＧＩＥＥＴＳＩ＾￡ＥＴＩ？＼＾Ｉ？＾?１１９??ＢｃＣＲ．ｓｅｑ?臓則＿５：１壓?ＣＴ’、’：Ｎ?邏：２１９??Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ?Ｉｖｎ?ａｇｖ?ｅｗ?ｎｌ?ｇｖ?ｌ??ＡｐＣＲ．ｓｅｑ?＇篇：ＸＬＰＩＸＲＫＡＫＷＡＨ僅?Ｉｓ｜￡ｌｇ＇”＇．：ＡＧＶＡ｜?韦

【参考文献】：
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本文编号：3246557