CRISPR/Cas9介导的ASGR1基因敲除猪制备

发布时间：2021-06-24 09:11

　　猪（Sus scrofa）内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1（asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1）是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一。本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因（α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1）敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9）结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNA1（single guide RNA1,sg RNA1）,将sg RNA1与增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆。实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90%,其中双等位基因... 

【文章来源】：农业生物技术学报. 2016,24(08)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 实验材料及主要试剂
    1.2 实验方法
        1.2.1 规律成簇间隔短回文重复(clustered regular-ly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRIS-PR/Cas9)打靶载体的设计及构建
        1.2.2 sg RNA基因突变效率检测
        1.2.3 细胞转染、筛选及单细胞克隆鉴定
        1.2.4 基因敲除猪的制备及鉴定
        1.2.5 脱靶效应分析
        1.2.6 Western blot检测
2 结果与分析
    2.1 sg RNA打靶载体的构建及基因突变效率检测
    2.2 阳性单细胞克隆鉴定
    2.3 敲除猪的制备及鉴定
    2.4 脱靶分析
    2.5 Western blot检测
3 讨论
4 结论


【参考文献】：
期刊论文
[1]Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J]. BAO Lei,CHEN HaiDe,JONG UiMyong,RIM CholHo,LI WenLing,LIN XiJuan,ZHANG Dan,LUO Qiong,CUI Chun,HUANG HeFeng,ZHANG Yan,XIAO Lei,FU ZhiXin.  Science China（Life Sciences）. 2014(02)
[2]利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因[J]. 郑道山,冯冲,朱彦宾,龙川,冯书堂,潘登科,马文丽.  生物技术通讯. 2011(04)
[3]体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪[J]. 潘登科,张莉,周艳荣,冯冲,龙川,刘晓,董恩球,王树臣,万荣,张健,陈红星.  中国科学（C辑:生命科学）. 2009(03)



本文编号：3246813