慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

发布时间：2021-06-25 18:09

　　为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装（三质粒系统）并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10⁶ TU·mL^-1之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药（Puro）进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的... 

【文章来源】：扬州大学学报(农业与生命科学版). 2020,41(04)北大核心

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

Cas9-293T单细胞筛选

Cas9-293T提取RNA验证

Cas9片段扩增产物

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3249690