百合鳞茎发育过程中蔗糖合成酶基因的功能研究
发布时间：2021-06-26 07:54
百合（Lilium）作为国际四大切花之一,在全球花卉产业中具有重要地位。种球生产是百合产业的关键环节。现有研究表明鳞茎发育与淀粉积累密切相关,蔗糖作为百合鳞茎内糖分转运的主要形式,在蔗糖合成酶（Sucrose Synthase,SuSy,EC 2.4.1.13）调控下参与淀粉合成,对鳞茎形态建成具有重要意义。目前国内外对百合植株生长发育过程中鳞茎物质代谢的研究仅限于生理层面,分子研究尚少。为探究SuSy对百合鳞茎蔗糖-淀粉代谢的调控机理,本试验在前期成功克隆LdSuSy基因的基础上,系统探究了LdSuSy基因的分子生理功能。首次利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功对百合LdSuSy基因进行了定向编辑,获得敲除突变体;同时构建LdSuSy过表达载体并利用农杆菌介导法获得转基因株系;以敲除突变体和LdSuSy转基因株系为材料,结合qRT-PCR技术和生理测定研究了LdSuSy对百合植株及鳞茎发育的影响。主要试验结果如下:1.利用双酶切法构建了融合表达载体LdSuSy1-GFP和LdSuSy3-GFP,采用农杆菌介导法在烟草叶片中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察,证实LdSuSy1...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
库组织细胞中糖--淀粉代谢（SteinOandGranotD.,2019）
沈阳农业大学硕士学位论文17浴30min后立即42°C热激90s，立即再次冰浴3min，加入500μLLB液体培养基后震荡培养1h（37°C，200rpm）。在待涂菌液中加入16μLX-gal（20mg·mL-1），8μLIPTG（50mg·mL-1），将药品颠倒混匀。吸取200μL菌液均匀涂在含有100mg·L-1Amp的LB抗性平板上，将平板倒置在37°C恒温箱培养24h，待平板长出单克隆菌落，挑取白色单菌落进行菌落PCR鉴定。同时将菌挑取在含有100mg·L-1Amp的LB液体培养基内震荡培养（37°C，200rpm）。选取菌液PCR结果与预期片段大小相同的菌液送往生工生物工程有限公司进行测序验证。选择验证正确的菌液进行扩摇，提取质粒后于-20°C保存。（2）双酶切载体和目的片段图2-1植物表达载体pRI101多克隆位点Fig.2-1CloningsiteofexpressionvectorpRI101利用NdeI和BamHI对表达载体pRI101-GFP及PCR产物LdSuSy-Y进行双酶切，反应体系如表2-9。表2-9酶切pRI101及LdSuSy-Y反应体系Table2-9EnzymecutpRI101andLdSuSy-Yreactionsystem试剂Reagents体积（μL）Volume（μL）10×TBufferII3.0NdeI1.0BamhI1.0pRI101及LdSuSy-Y5.037°C酶切3h，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物后，采用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。再次用1.5%琼脂糖凝胶电泳胶检测回收产物，验证与预期片段大小相符后，用于后续试验。（4）载体与目的片段的连接
图2-2双靶点PCR扩增片段结构
【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米蔗糖合成酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析[J]. 陈曙,赵秋芳,陈宏良,金辉. 西南农业学报. 2019(11)
[2]白及蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析[J]. 蒋素华,牛苏燕,周一冉,崔波,梁芳,袁秀云,马杰. 广西植物. 2020(02)
[3]铁棍山药SUS基因CDS区克隆与生物信息学分析[J]. 刘苏伟,文艺,张骆琪,高素霞,刘玉霞,王飞,鲁传涛,刘红彦. 中国实验方剂学杂志. 2019(09)
[4]铁皮石斛蔗糖合成酶基因序列特征与表达模式分析[J]. 张园,刘正杰,徐绍忠,赵明富,林春,文国松. 分子植物育种. 2018(20)
[5]无籽蜜柚蔗糖合成酶（SUS）和蔗糖转化酶（INV）基因家族生物信息学及表达分析[J]. 邓舒雅,麦贻婷,陈惠萍,钮俊. 植物生理学报. 2018(10)
[6]植物蔗糖合成酶基因研究进展[J]. 秦翠鲜,桂意云,陈忠良,汪淼,廖芬,李杨瑞,黄东亮. 分子植物育种. 2018(12)
[7]干旱胁迫下发菜蔗糖合成酶基因Sus2克隆与差异表达[J]. 李晓旭,丁苗苗,刘阳,王猛,严奉坤,梁文裕,徐婷婷,王俊,王玲霞. 分子植物育种. 2018(20)
[8]大豆蔗糖合成酶家族成员的全基因组鉴定及表达分析[J]. 晁毛妮,张自阳,王润豪,张金宝,王果,黄中文. 西北植物学报. 2018(02)
[9]枣蔗糖合成酶基因SS6的克隆及表达分析[J]. 冯延芝,魏琦琦,何潇,张伟健,赵广,张琳. 经济林研究. 2017(04)
[10]2个Sh2甜玉米自交系种子萌发过程中关键水解酶活性及相关基因表达的动态分析[J]. 程昕昕,牛永胜,刘正. 植物资源与环境学报. 2015(03)
硕士论文
[1]兰州百合蔗糖代谢关键酶基因的克隆及原核表达[D]. 程金云.沈阳农业大学 2017
[2]水稻蔗糖合成酶基因RNAi株系的构建及原核表达[D]. 刁灿.山东大学 2014
[3]波兰小麦蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析[D]. 郑翰.四川农业大学 2014
[4]甜瓜果实蔗糖合成酶基因（SS）的克隆、表达分析及遗传转化[D]. 闻小霞.山东农业大学 2010
[5]甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆及其结构分析[D]. 雷美华.福建师范大学 2008
[6]农杆菌介导的蔗糖合成酶基因转化花生的研究[D]. 闻珊珊.东北师范大学 2007
本文编号：3250957
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
库组织细胞中糖--淀粉代谢（SteinOandGranotD.,2019）
沈阳农业大学硕士学位论文17浴30min后立即42°C热激90s，立即再次冰浴3min，加入500μLLB液体培养基后震荡培养1h（37°C，200rpm）。在待涂菌液中加入16μLX-gal（20mg·mL-1），8μLIPTG（50mg·mL-1），将药品颠倒混匀。吸取200μL菌液均匀涂在含有100mg·L-1Amp的LB抗性平板上，将平板倒置在37°C恒温箱培养24h，待平板长出单克隆菌落，挑取白色单菌落进行菌落PCR鉴定。同时将菌挑取在含有100mg·L-1Amp的LB液体培养基内震荡培养（37°C，200rpm）。选取菌液PCR结果与预期片段大小相同的菌液送往生工生物工程有限公司进行测序验证。选择验证正确的菌液进行扩摇，提取质粒后于-20°C保存。（2）双酶切载体和目的片段图2-1植物表达载体pRI101多克隆位点Fig.2-1CloningsiteofexpressionvectorpRI101利用NdeI和BamHI对表达载体pRI101-GFP及PCR产物LdSuSy-Y进行双酶切，反应体系如表2-9。表2-9酶切pRI101及LdSuSy-Y反应体系Table2-9EnzymecutpRI101andLdSuSy-Yreactionsystem试剂Reagents体积（μL）Volume（μL）10×TBufferII3.0NdeI1.0BamhI1.0pRI101及LdSuSy-Y5.037°C酶切3h，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物后，采用DNA胶回收试剂盒回收目的片段。再次用1.5%琼脂糖凝胶电泳胶检测回收产物，验证与预期片段大小相符后，用于后续试验。（4）载体与目的片段的连接
图2-2双靶点PCR扩增片段结构
【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米蔗糖合成酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析[J]. 陈曙,赵秋芳,陈宏良,金辉. 西南农业学报. 2019(11)
[2]白及蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析[J]. 蒋素华,牛苏燕,周一冉,崔波,梁芳,袁秀云,马杰. 广西植物. 2020(02)
[3]铁棍山药SUS基因CDS区克隆与生物信息学分析[J]. 刘苏伟,文艺,张骆琪,高素霞,刘玉霞,王飞,鲁传涛,刘红彦. 中国实验方剂学杂志. 2019(09)
[4]铁皮石斛蔗糖合成酶基因序列特征与表达模式分析[J]. 张园,刘正杰,徐绍忠,赵明富,林春,文国松. 分子植物育种. 2018(20)
[5]无籽蜜柚蔗糖合成酶（SUS）和蔗糖转化酶（INV）基因家族生物信息学及表达分析[J]. 邓舒雅,麦贻婷,陈惠萍,钮俊. 植物生理学报. 2018(10)
[6]植物蔗糖合成酶基因研究进展[J]. 秦翠鲜,桂意云,陈忠良,汪淼,廖芬,李杨瑞,黄东亮. 分子植物育种. 2018(12)
[7]干旱胁迫下发菜蔗糖合成酶基因Sus2克隆与差异表达[J]. 李晓旭,丁苗苗,刘阳,王猛,严奉坤,梁文裕,徐婷婷,王俊,王玲霞. 分子植物育种. 2018(20)
[8]大豆蔗糖合成酶家族成员的全基因组鉴定及表达分析[J]. 晁毛妮,张自阳,王润豪,张金宝,王果,黄中文. 西北植物学报. 2018(02)
[9]枣蔗糖合成酶基因SS6的克隆及表达分析[J]. 冯延芝,魏琦琦,何潇,张伟健,赵广,张琳. 经济林研究. 2017(04)
[10]2个Sh2甜玉米自交系种子萌发过程中关键水解酶活性及相关基因表达的动态分析[J]. 程昕昕,牛永胜,刘正. 植物资源与环境学报. 2015(03)
硕士论文
[1]兰州百合蔗糖代谢关键酶基因的克隆及原核表达[D]. 程金云.沈阳农业大学 2017
[2]水稻蔗糖合成酶基因RNAi株系的构建及原核表达[D]. 刁灿.山东大学 2014
[3]波兰小麦蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析[D]. 郑翰.四川农业大学 2014
[4]甜瓜果实蔗糖合成酶基因（SS）的克隆、表达分析及遗传转化[D]. 闻小霞.山东农业大学 2010
[5]甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆及其结构分析[D]. 雷美华.福建师范大学 2008
[6]农杆菌介导的蔗糖合成酶基因转化花生的研究[D]. 闻珊珊.东北师范大学 2007
本文编号：3250957
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