羽衣甘蓝外显子连接复合体相关基因克

发布时间：2021-06-26 09:59

　　外显子连接复合体（exon j unction complex,EJC）位于核质中,参与内含子的剪接过程,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala）作为实验材料,其属于十字花科芸薹属,为我国北方重要的观赏和食用植物。柱头作为花粉接受的场所,其生长发育对植物是否能够繁殖起到了极其重要的作用。为了进一步探讨EJC及其核心外围互作蛋白在参与调控柱头发育过程中的作用机制,我们分离了羽衣甘蓝柱头中EJC核心蛋白基因Mago,eIF4AⅢ和UAP56,及EJC外围蛋白基因GRP、CP29A;利用原核表达纯化技术得到了这些基因的蛋白,并且制备了其多克隆抗体。通过实时定量PCR分析BoMago、BoeIF4AⅢ、BoUAP56基因在柱头发育过程中的表达量情况;通过免疫印迹的方法检测BoMago、BoeIF4AⅢ、BoUAP56蛋白在柱头发育各时期的表达情况;最后通过酵母双杂交实验分析蛋白质间的相互作用。主要获得的研究结果如下:（1）羽衣甘蓝BoMago开放读码框长447 bp,编码148个氨基酸;BoeIF4AⅢ开放读码框长... 

【文章来源】：东北林业大学黑龙江省 211工程院校 教育部直属院校

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图２－１羽衣甘蓝柱头总ＲＮＡ的提取结果??

５Ｓ??图２－１羽衣甘蓝柱头总ＲＮＡ的提取结果??２．３＿２?ＲＴ－ＰＣＲ克隆基因??以羽衣甘蓝柱头总ＲＮＡ为模板，反转录获得ｃＤＮＡ，以ｐＥＴ引物进行ＰＣＲ反应。??在１２００?ｂｐ左右得到了两条明显的条带，在５００?ｂｐ左右得到了三条明显的条带，在９００?ｂｐ??左右得到了一条明显的条带都与预期基因的大小相苻（如图２－２所示）。将目的片段与??酶切后的ｐＥＴ－１４ｂ载体连接后转化ＤＨ５ｏｔ感受态细胞，进行菌液ＰＣＲ结果与预期基因大??小相符（如图２－３所示）。??

３?ＥＪＣ在柱头发育各时期的表达分析??３．３结果与分析??３．３．１羽衣甘蓝不同发育时期柱头总ＲＮＡ的提取??收集Ｓ卜Ｓ５时期羽衣甘蓝柱头并提取总ＲＮＡ，通过ＮａｎｏＤｒｏｐ－２０００测量，ＯＤ２６０／２８０??值均在１．８－２．０。琼脂糖凝胶电泳表明（图３－１），柱头ＲＮＡ良好无明显降解，可用于后续??实验，通过ＮａｎｏＤｒｏｐ－２０００测量并调整Ｓ１－Ｓ５时期ＲＮＡ溶液浓度一致约为１?ｐｇ／ｎＬ左右。??Ｓ１??２８Ｓ??ｉ８ｓ??图３－１：?Ｓ１时期柱头总ＲＮＡ电泳图??３．３．２?ｑＲＴ－ＰＣＲ引物特异性检测??提取羽衣甘蓝Ｓ１－Ｓ５时期柱头ＲＮＡ，去除基因组ＤＮＡ后，通过反转录试剂盒获得??ｃＤＮＡ。分另ＩＪ对５ｏＭａｇｏ、尸允基因实时定量引物进行ＰＣＲ，通过琼月旨??糖凝胶电泳结果，发现扩增出的基因条带单一，并与预期结果一致（图３－２）。说明引物??特异性较好，可用于ｑＲＴ－ＰＣＲ的分析。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３??１００??图３－２：?ｑＲＴ－ＰＣＲ引物特异性检测??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ＢｏＭａｇｏ；?２：?ＢｏｅＩＦ４Ａ；?３：?ＢｏＵＡＰ５６??３．３．３?ＢｏＭａｇｏｘ?ＢｏｅＩＦ４ＡｌＩＩｓ?ＢｏＵＡＰ５６＾＾＾Ｕ??为了研究５ｏＭａｇｏ、５ｏｅ／／４４／／／、５〇似户５６基因在柱头发育Ｓ１－Ｓ５时期的表达情况，??以Ａｃｔｉｎ作为内参基因进行了?ｑＲＴ－ＰＣＲ分析ｉ＾７ＡＰ５６基因在柱??头发育各时期的相对表达情况（如图３－３）。发现这三个基因在柱头发育早期Ｓ１时期具??有最高的表达量，随着柱头的成熟表达量下降，Ｓ５时期表达量最低。??－３５－??

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3251133