优化大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用

发布时间：2021-06-26 16:26

　　CRISPR/Cas9基因编辑系统目前已经广泛地应用于大肠杆菌工程菌株的构建,若能构建出一种能连续进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统,将极大地提高大肠杆菌工程菌株构建的效率。设计并构建了具有自剪切功能的供体质粒pV4,优化了双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现了基因的连续敲除或整合。pV4质粒,在原始供体质粒placZ的骨架区域添加3个元件:针对供体质粒上氯霉素基因cat的N20-gRNA序列;Ptrc启动子,用于表达cat-N20-gRNA;lacI^q序列,用于表达LacI蛋白调控Ptrc启动子。pV4供体系列质粒（敲除或整合）实现基因编辑后,cat-N20-gRNA在IPTG的诱导表达引导Cas9蛋白对供体质粒进行自剪切,从而方便下一轮基因的编辑。将pV4系列质粒（敲除或整合）应用于产衣康酸工程菌株的构建,连续敲除ptsI、iclR及整合cad基因,基因编辑结果显示,优化后的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,能快速消除供体质粒,实现基因的连续敲除或整合,节约了基因操作的时间,有广泛的工程菌株构建应用前景。 

【文章来源】：生物学杂志. 2020,37(04)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

优化大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统

为优化双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现对基因的连续编辑,对供体DNA质粒进行了改造:在供体质粒placZ的骨架区域添加上3个元件:cat-N20-gRNA元件,以placZ质粒为模板,用引物cat-N20-up/cat-N20-down扩增得到,大小400 bp(图2-A,泳道2);元件lacIq和元件Ptrc在质粒pMACYC184上相邻,用引物lacI-Ptrc-up/lacI-Ptrc-down扩增得到,大小1.5 kb(图2-A,泳道3)。将这3个元件和placZ反向扩增的骨架片段(图2-A,泳道1)用Golden Gate策略组装,得到pV4质粒(图2-B)。pV4质粒含有自剪切元件lacIq-Ptrc-cat-N20-gRNA,在IPTG诱导和Cas9蛋白作用下,可以实现质粒的自我消除。2.3 应用优化的CRISPR/Cas9基因编辑系统快速构建工程菌株

按照Golden Gate的片段组装策略,分别组装ptsI、iclR敲除型质粒和cad整合型质粒。组装产物转化Trans T1感受态细胞,得到的克隆PCR验证分析后送样测序,组装正确的效率达到100%。pV4-del-ptsI,pV4-del-iclR和pV4-del-araBAD-ins-cad的质粒电泳图,见图3-D 泳道1、2和3。2.3.2 基因的连续敲除及其供体质粒的消除

【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas系统在大肠杆菌代谢与发酵工程中的应用[J]. 王琳,毛旭丹,裘娟萍,孙东昌.  食品与发酵科技. 2018(03)
[2]代谢工程技术方法研究进展[J]. 杨祖明,李炳志.  生物加工过程. 2018(01)
[3]大肠杆菌染色体上严谨型启动子的构建[J]. 仇焕娜,赵东东,满淑丽,毕昌昊,朱欣娜,张学礼.  微生物学通报. 2018(08)
[4]质粒消除方法及消除效果的评价研究[J]. 龙海英,刘衡川,方梅.  中国卫生检验杂志. 2007(03)

硕士论文
[1]改造大肠杆菌提高丁二酸生产速率和转化率[D]. 陈晶.天津科技大学 2014



本文编号：3251672