基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

发布时间：2021-06-29 00:58

　　目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对M... 

【文章来源】：中国实验动物学报. 2017,25(06)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 小鼠MAD2L1基因序列分析和基因敲除靶点序列设计
        1.2.2 用于敲除小鼠MAD2L1的CRISPR/Cas9载体 (Cas9-MAD2L1) 构建
            (1) Oligo二聚体的形成
            (2) Oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体中
        1.2.3 Cas9-MAD2L1载体转染小鼠NIH/3T3细胞和嘌呤霉素筛选
        1.2.4 小鼠MAD2L1基因修饰分析
        1.2.5 Cas9-MAD2L1脱靶效应分析
2 结果
    2.1 小鼠MAD2L1基因修饰靶点设计结果
    2.2 用于敲除小鼠MAD2L1的CRISPR/Cas9载体 (Cas9-MAD2L1) 构建结果
    2.3 荧光显微镜观察嘌呤霉素筛选Cas9-MAD2L1载体转染后的NIH/3T3细胞
    2.4 MAD2L1基因敲除结果分析
    2.5 脱靶效应分析
3 讨论



本文编号：3255390