金铁锁HMGR、FPS、SE和P450基因克

发布时间：2017-04-25 06:06

  本文关键词：金铁锁HMGR、FPS、SE和P450基因克隆、生物信息学及表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：稀有濒危物种金铁锁(Psammosilene tunicoides)为石竹科(Caryophyllaceae)单种属植物,以根入药,是“云南白药”的主成分之一,主要有效成分为金铁锁三萜总皂苷。金铁锁自然繁殖力低,生长缓慢,加之金铁锁药材大部分依赖野生采挖,使之野生资源日益减少,几近枯竭,已不能满足市场需求。从分子水平阐明金铁锁三萜总皂苷生物合成途径,找到控制三萜皂苷合成的关键酶基因,利用基因工程技术对金铁锁三萜皂苷进行体外合成,是获得金铁锁三萜皂苷快速而有效的新途径。本研究从金铁锁中克隆了4个可能参与三萜皂苷合成关键酶基因,成功构建原核表达体系诱导蛋白表达,检测了关键酶基因的组织表达差异。主要研究内容如下:基于课题组前期研究中所获得的金铁锁转录组信息,从大量转录本信息中筛选了可能参与金铁锁三萜皂苷合成的序列,包括参与三萜前体形成的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法尼基焦磷酸合成酶(FPS),骨架构建阶段的鲨烯环氧酶(SE),以及修饰阶段的细胞色素P450单加氧酶(P450)等关键酶基因。根据转录本序列,设计各基因的全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得金铁锁各基因的全长cDNA序列:获得全长1716bp的HMGR,ORF1641bp,编码546个氨基酸,蛋白分子量约为58KD;获得全长1135bp的FPS,ORF 1029bp,编码342个氨基酸,生物信息学分析FPS蛋白的分子量约为39KD;获得两条SE,SE-1全长1642bp,ORF 1578bp,编码525个氨基酸,蛋白分子量约为57.3KD;SE-2全长1552bp,ORF 1446bp,编码481个氨基酸,蛋白分子量约为52.3KD;获得全长1612 bp的金铁锁P450,ORF 1560 bp,编码519个氨基酸,蛋白分子量约为60KD;并构建各基因相应原核表达体系成功诱导蛋白表达;对所编码的蛋白进行了生物信息学分析,各基因均与其他已知植物的相关基因有较高同源性;利用实时荧光定量PCR检测实验组所获得的金铁锁关键酶基因在不同产地不同组织的表达情况表明:除金铁锁P450的趋势为在叶中的相对表达量最高外,其他酶基因总体趋势均是在根中高表达。首次从金铁锁中克隆出HMGR、FPS、SE、P450酶基因并进行原核表达研究,对三萜合成途径中的关键酶基因的组织表达特异性进行了初步的检测,根据研究结果推测所克隆得到的金铁锁FPS、SE-1、SE-2、HMGR可能参与三萜皂苷的合成,而得到的P450则可能是参与甾醇的合成。本研究为进一步阐明三萜皂苷合成途径提供重要线索,并对后续金铁锁合成生物学研究奠定基础。
【关键词】：金铁锁 基因克隆 原核表达 实时荧光定量 生物信息学分析
【学位授予单位】：云南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-13
• 第一章 金铁锁HMGR的克隆、原核表达及生物信息学分析13-37
• 第一节 实验材料、试剂及仪器13-16
• 1 实验材料13-14
• 2 实验试剂14-15
• 3 实验仪器15-16
• 第二节 实验方法16-28
• 1 金铁锁HMGR基因克隆16-22
• 2 HMGR基因的原核表达22-27
• 3 HMGR生物信息学分析27-28
• 第三节 实验结果28-37
• 1 金铁锁根部RNA的提取28-29
• 2 金铁锁HMGR的克隆29-30
• 3 金铁锁HMGR的原核表达30-31
• 4 金铁锁HMGR的生物信息学分析31-37
• 第二章 金铁锁FPS的克隆、原核表达及生物信息学分析37-47
• 第一节 实验材料、试剂及仪器37
• 第二节 实验方法37-38
• 第三节 实验结果38-47
• 1 金铁锁FPS的克隆38-39
• 2 金铁锁FPS的原核表达39-40
• 3 金铁锁FPS的生物信息学分析40-47
• 第三章 金铁锁SE的克隆、原核表达及生物信息学分析47-60
• 第一节 实验材料、试剂及仪器47-48
• 第二节 实验方法48
• 第三节 实验结果48-60
• 1 金铁锁SE的克隆48-49
• 2 金铁锁SE的原核表达49-50
• 3 金铁锁SE的生物信息学分析50-60
• 第四章 金铁锁P450的克隆、原核表达及生物信息学分析60-68
• 第一节 实验材料、试剂及仪器60
• 第二节 实验方法60-61
• 第三节 实验结果61-68
• 1 金铁锁P450的克隆61-62
• 2 金铁锁P450的原核表达62-63
• 3 金铁锁P450的生物信息学分析63-68
• 第五章 金铁锁8个关键酶基因的表达分析68-77
• 第一节 实验材料、试剂及仪器68-69
• 1 实验材料68
• 2 实验试剂68-69
• 3 实验仪器69
• 第二节 实验方法69-72
• 1 金铁锁根、茎、叶RNA提取69
• 2 cDNA合成69-70
• 3 确定进行荧光检测的基因及引物设计70-71
• 4 Real-time PCR反应71-72
• 第三节 实验结果72-77
• 第六章 讨论77-85
• 第七章 文献综述85-96
• 第一节 植物萜类化合物生物合成途径及其关键酶85-91
• 1 植物萜类化合物生物合成途径85-87
• 2 甲羟戊酸途径中的关键酶87-91
• 第二节 金铁锁及其三萜皂苷的研究现状91-94
• 1 金铁锁简介91-93
• 2 金铁锁三萜皂苷的研究93-94
• 第三节 实时荧光定量PCR94-95
• 第四节 本研究的目的及意义95-96
• 参考文献96-102
• 附录102-109
• 致谢109-110

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本文编号：325757