油菜核不育材料7365A恢复基因Bnams4 a 的功能验证
发布时间：2021-07-03 09:49
细胞核雄性不育是我国油菜杂种优势利用的重要途径之一。甘蓝型油菜细胞核雄性不育材料7365系统的育性被认为受两对基因控制,即BnaMs3/Bnams3和Bnams4a/Bnams4b/Bnams4c。前人推测Bnams4a可能是通过DNA甲基化相关过程恢复Bnams4b导致雄性不育。本研究在前人基础上,通过对仅在Bnams4a位点分离的736512AB近等基因系进行了全基因组重亚硫酸盐测序比较分析;通过转化反向重复表达载体等实验,对前人提出的sRNA通过RNA介导的DNA甲基化（RNA directed DNA methylation,RdDM）调控育性的观点进行验证;通过BAC的单分子实时测序（single molecule real time,SMRT）对与Bnams4a紧密连锁的基因进行验证与排除;在甘蓝型油菜7365A中进行Bnams4a全长序列的遗传转化验证,并对启动子中的串联重复序列进行截短分析。本研究...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 前言
1.1 植物中DNA甲基化
1.2 DNA甲基化状态的建立、维持与去除
1.3 DNA甲基化的功能
1.3.1 启动子DNA甲基化与基因表达调控
1.3.2 Gene body区 DNA甲基化的功能
1.4 DNA甲基化分析方法
1.5 DNA甲基化在植物雄性不育中的研究
1.6 甘蓝型油菜全基因组DNA甲基化研究
1.7 油菜雄性不育与杂种优势利用
1.8 S45A雄性不育分子机理研究进展
1.8.1 Bnms1和Bnms2 的定位与克隆
1.8.2 S45A育性控制机理
1.9 9012A/7365A雄性不育分子机理研究进展
1.9.1 BnaMs3 的图位克隆与及其新功能化
1.9.2 9012A/7365A遗传模式修正
1.9.3 Bnams4~b的图位克隆
1.9.4 7365A育性控制的分子机理研究
1.10 显性核不育宜3A雄性不育分子机理研究进展
1.10.1 BnaMs5的定位与克隆
1.10.2 显性核不育的育性控制机理
1.11 细胞核不育利用途径
1.12 本研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 油菜材料
2.2 拟南芥材料
2.3 菌株与载体
2.4 全基因DNA甲基化测序与分析
2.4.1 文库构建与全基因组重亚硫酸盐测序
2.4.2 测序质量控制
2.4.3 比对到参考基因组
2.4.4 差异甲基化区域(DMR)分析
2.5 常规重亚硫酸盐PCR测序验证
2.6 RNA提取、反转录与荧光定量PCR
2.7 载体构建
2.7.1 反向重复载体构建
2.7.2 gDNA超表达的构建
2.7.3 CRISPR/Cas9 载体构建
2.7.4 互补载体构建
2.7.5 启动子截短载体构建
2.8 简单粗暴法提取DNA
2.9 BAC的单分子实时测序与拼接
2.10 花药醋酸洋红染色
2.11 花药亚历山大染色
2.12 甘蓝型油菜遗传转化
2.13 拟南芥根外植体遗传转化
2.14 拟南芥蘸花法遗传转化及转基因阳性苗筛选
3 结果与分析
3.1 近等基因系表型观察
3.2 油菜花蕾全基因组甲基化分析
3.2.1 油菜花蕾全基因组甲基化图谱
3.2.2 差异甲基化位点分析
3.2.3 差异甲基化基因验证
3.2.4 育性相关基因定量PCR验证
3.3 Bnams4甲基化与表达分析
3.4 sRNA区转基因验证
3.4.1 sRNA超表达表型分析
3.4.2 sRNA超表达DNA甲基化与基因表达分析
3.4.3 CRISPR/Cas9编辑sRNA区结果
3.4.4 gDNA超表达转基因结果
3.5 Bnams4~a转化拟南芥结果
3.6 BAC的重新测序与验证
3.6.1 BAC单分子实时测序与分析验证
3.6.2 新发现的2个基因的转基因验证
3.7 Bnams4~a油菜转基因验证
3.7.1 Bnams4~a全长转化不育背景油菜
3.7.2 育性恢复株中Bnams4 甲基化与表达分析
3.8 Bnams4 启动子tandem repeat初步分析
4 讨论
4.1 油菜花蕾全基因组甲基化图谱
4.2 WGBS在鉴定育性相关基因中的应用
4.3 Bnams4调控区的sRNA可能不是育性恢复的原因
4.4 Bnams4~a是Bnams4~b的复等位基因
4.5 Bnams4~a恢复育性的可能机制
参考文献
附录Ⅰ
附录1 油菜下胚轴遗传转化培养基配方
附录2 拟南芥根外植体遗传转化配方
附录3 使用SeqMan批量去除载体序列流程
附录4 本研究所用BS PCR和q-RT PCR引物
附录5 本研究用到的其他引物
附图1 19条染色体在三种序列环境下的DNA甲基化分布
附图2 ChrC1上24MB位置处的一个局部DNA甲基化差异
附图3-1 3个基因的常规重亚硫酸盐PCR验证
附图3-2 2个基因的常规重亚硫酸盐PCR验证
附图4 806 ORF与 BnaA06g31090D氨基酸序列比较
附图5 1667 ORF与拟南芥同源基因氨基酸序列比较
附图6 油菜CRISPR/Cas9植株T2 代混合测序结果
附录Ⅱ:作者简历及研究生阶段发表论文成果
作者简历
文章发表
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]以新需求为导向的油菜产业发展战略[J]. 王汉中. 中国油料作物学报. 2018(05)
[2]基于分子标记的油菜隐性核不育7-7365AB遗传模式探究[J]. 俎峰,夏胜前,顿小玲,周正富,曾芳琴,易斌,文静,马朝芝,沈金雄,涂金星,傅廷栋. 中国农业科学. 2010(15)
[3]甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB遗传模式新释[J]. 董发明,洪登峰,刘平武,谢彦周,何庆彪,杨光圣. 华中农业大学学报. 2010(03)
[4]我国油菜产业发展的历史回顾与展望[J]. 王汉中. 中国油料作物学报. 2010(02)
[5]甘蓝型油菜显性核不育基因及与恢复基因的等位性分析[J]. 宋来强,傅廷栋,杨光圣,涂金星,马朝芝. 中国农业科学. 2006(03)
[6]1对复等位基因控制的油菜（Brassica napus L.）显性核不育系609AB的遗传验证[J]. 宋来强,傅廷栋,杨光圣,涂金星,马朝芝. 作物学报. 2005(07)
[7]甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系9012A与6AB和S45AB遗传对比[J]. 陈凤祥,胡宝成,代秉勋,候树敏,李强生,吴新杰,费维新,张曼琳. 安徽农业科学. 1998(03)
[8]甘蓝型油菜核不育材料育性基因的RAPD标记[J]. 涂金星,郑用琏,傅廷栋. 华中农业大学学报. 1997(02)
[9]油菜显性核不育三系法制种[J]. 李树林,周志疆,周熙荣. 上海农业学报. 1995(01)
[10]甘蓝型油菜细胞核雄性不育材料9012A的发现与初步研究[J]. 陈凤祥,胡宝成,李强生,张曼琳. 北京农业大学学报. 1993(S4)
博士论文
[1]甘蓝型油菜隐性核不育材料7365AB蛋白质组差异分析[D]. 秦毛毛.华中农业大学 2016
[2]甘蓝型油菜细胞核雄性不育基因BnMS5的克隆和功能分析[D]. 辛强.华中农业大学 2016
[3]甘蓝型油菜“花叶”基因的精细定位及其在杂种优势利用中的应用[D]. 倪西源.浙江大学 2014
[4]甘蓝型油菜核不育系7365A恢复基因克隆和进化分析[D]. 顿小玲.华中农业大学 2013
[5]油菜细胞核雄性不育基因Bnms3的克隆及功能标记开发[D]. 李季.华中农业大学 2012
[6]甘蓝型油菜核不育系9012AB的遗传模式修正与BnRf位点的物理定位[D]. 董发明.华中农业大学 2012
[7]甘蓝型油菜隐性核不育分子机理及相关基因功能分析[D]. 周正富.华中农业大学 2011
[8]中国油菜生产技术供需的经济学分析[D]. 李争.华中农业大学 2011
[9]油菜S45AB隐性核不育分子机理与应用研究[D]. 曾芳琴.华中农业大学 2010
[10]甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnMS2的精细定位与候选基因鉴定[D]. 雷绍林.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]甘蓝型油菜7365恢复基因BnaMs3作用机理研究[D]. 郭翔.华中农业大学 2018
[2]不同作物Tic40对新型嵌合基因Bnams4b功能的影响[D]. 田甜甜.华中农业大学 2017
[3]热激打破Bnams4b引起的拟南芥雄性不育及其转录组分析[D]. 樊煜.华中农业大学 2017
[4]甘蓝型油菜隐性细胞核不育恢复基因BnMs4的精细定位及候选区段确定[D]. 程玲.华中农业大学 2012
[5]甘蓝型油菜隐性上位核不育的分子机理研究[D]. 朱云.华中农业大学 2008
本文编号：3262348
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：125 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
1 前言
1.1 植物中DNA甲基化
1.2 DNA甲基化状态的建立、维持与去除
1.3 DNA甲基化的功能
1.3.1 启动子DNA甲基化与基因表达调控
1.3.2 Gene body区 DNA甲基化的功能
1.4 DNA甲基化分析方法
1.5 DNA甲基化在植物雄性不育中的研究
1.6 甘蓝型油菜全基因组DNA甲基化研究
1.7 油菜雄性不育与杂种优势利用
1.8 S45A雄性不育分子机理研究进展
1.8.1 Bnms1和Bnms2 的定位与克隆
1.8.2 S45A育性控制机理
1.9 9012A/7365A雄性不育分子机理研究进展
1.9.1 BnaMs3 的图位克隆与及其新功能化
1.9.2 9012A/7365A遗传模式修正
1.9.3 Bnams4~b的图位克隆
1.9.4 7365A育性控制的分子机理研究
1.10 显性核不育宜3A雄性不育分子机理研究进展
1.10.1 BnaMs5的定位与克隆
1.10.2 显性核不育的育性控制机理
1.11 细胞核不育利用途径
1.12 本研究的目的和意义
2 材料和方法
2.1 油菜材料
2.2 拟南芥材料
2.3 菌株与载体
2.4 全基因DNA甲基化测序与分析
2.4.1 文库构建与全基因组重亚硫酸盐测序
2.4.2 测序质量控制
2.4.3 比对到参考基因组
2.4.4 差异甲基化区域(DMR)分析
2.5 常规重亚硫酸盐PCR测序验证
2.6 RNA提取、反转录与荧光定量PCR
2.7 载体构建
2.7.1 反向重复载体构建
2.7.2 gDNA超表达的构建
2.7.3 CRISPR/Cas9 载体构建
2.7.4 互补载体构建
2.7.5 启动子截短载体构建
2.8 简单粗暴法提取DNA
2.9 BAC的单分子实时测序与拼接
2.10 花药醋酸洋红染色
2.11 花药亚历山大染色
2.12 甘蓝型油菜遗传转化
2.13 拟南芥根外植体遗传转化
2.14 拟南芥蘸花法遗传转化及转基因阳性苗筛选
3 结果与分析
3.1 近等基因系表型观察
3.2 油菜花蕾全基因组甲基化分析
3.2.1 油菜花蕾全基因组甲基化图谱
3.2.2 差异甲基化位点分析
3.2.3 差异甲基化基因验证
3.2.4 育性相关基因定量PCR验证
3.3 Bnams4甲基化与表达分析
3.4 sRNA区转基因验证
3.4.1 sRNA超表达表型分析
3.4.2 sRNA超表达DNA甲基化与基因表达分析
3.4.3 CRISPR/Cas9编辑sRNA区结果
3.4.4 gDNA超表达转基因结果
3.5 Bnams4~a转化拟南芥结果
3.6 BAC的重新测序与验证
3.6.1 BAC单分子实时测序与分析验证
3.6.2 新发现的2个基因的转基因验证
3.7 Bnams4~a油菜转基因验证
3.7.1 Bnams4~a全长转化不育背景油菜
3.7.2 育性恢复株中Bnams4 甲基化与表达分析
3.8 Bnams4 启动子tandem repeat初步分析
4 讨论
4.1 油菜花蕾全基因组甲基化图谱
4.2 WGBS在鉴定育性相关基因中的应用
4.3 Bnams4调控区的sRNA可能不是育性恢复的原因
4.4 Bnams4~a是Bnams4~b的复等位基因
4.5 Bnams4~a恢复育性的可能机制
参考文献
附录Ⅰ
附录1 油菜下胚轴遗传转化培养基配方
附录2 拟南芥根外植体遗传转化配方
附录3 使用SeqMan批量去除载体序列流程
附录4 本研究所用BS PCR和q-RT PCR引物
附录5 本研究用到的其他引物
附图1 19条染色体在三种序列环境下的DNA甲基化分布
附图2 ChrC1上24MB位置处的一个局部DNA甲基化差异
附图3-1 3个基因的常规重亚硫酸盐PCR验证
附图3-2 2个基因的常规重亚硫酸盐PCR验证
附图4 806 ORF与 BnaA06g31090D氨基酸序列比较
附图5 1667 ORF与拟南芥同源基因氨基酸序列比较
附图6 油菜CRISPR/Cas9植株T2 代混合测序结果
附录Ⅱ:作者简历及研究生阶段发表论文成果
作者简历
文章发表
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]以新需求为导向的油菜产业发展战略[J]. 王汉中. 中国油料作物学报. 2018(05)
[2]基于分子标记的油菜隐性核不育7-7365AB遗传模式探究[J]. 俎峰,夏胜前,顿小玲,周正富,曾芳琴,易斌,文静,马朝芝,沈金雄,涂金星,傅廷栋. 中国农业科学. 2010(15)
[3]甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB遗传模式新释[J]. 董发明,洪登峰,刘平武,谢彦周,何庆彪,杨光圣. 华中农业大学学报. 2010(03)
[4]我国油菜产业发展的历史回顾与展望[J]. 王汉中. 中国油料作物学报. 2010(02)
[5]甘蓝型油菜显性核不育基因及与恢复基因的等位性分析[J]. 宋来强,傅廷栋,杨光圣,涂金星,马朝芝. 中国农业科学. 2006(03)
[6]1对复等位基因控制的油菜（Brassica napus L.）显性核不育系609AB的遗传验证[J]. 宋来强,傅廷栋,杨光圣,涂金星,马朝芝. 作物学报. 2005(07)
[7]甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系9012A与6AB和S45AB遗传对比[J]. 陈凤祥,胡宝成,代秉勋,候树敏,李强生,吴新杰,费维新,张曼琳. 安徽农业科学. 1998(03)
[8]甘蓝型油菜核不育材料育性基因的RAPD标记[J]. 涂金星,郑用琏,傅廷栋. 华中农业大学学报. 1997(02)
[9]油菜显性核不育三系法制种[J]. 李树林,周志疆,周熙荣. 上海农业学报. 1995(01)
[10]甘蓝型油菜细胞核雄性不育材料9012A的发现与初步研究[J]. 陈凤祥,胡宝成,李强生,张曼琳. 北京农业大学学报. 1993(S4)
博士论文
[1]甘蓝型油菜隐性核不育材料7365AB蛋白质组差异分析[D]. 秦毛毛.华中农业大学 2016
[2]甘蓝型油菜细胞核雄性不育基因BnMS5的克隆和功能分析[D]. 辛强.华中农业大学 2016
[3]甘蓝型油菜“花叶”基因的精细定位及其在杂种优势利用中的应用[D]. 倪西源.浙江大学 2014
[4]甘蓝型油菜核不育系7365A恢复基因克隆和进化分析[D]. 顿小玲.华中农业大学 2013
[5]油菜细胞核雄性不育基因Bnms3的克隆及功能标记开发[D]. 李季.华中农业大学 2012
[6]甘蓝型油菜核不育系9012AB的遗传模式修正与BnRf位点的物理定位[D]. 董发明.华中农业大学 2012
[7]甘蓝型油菜隐性核不育分子机理及相关基因功能分析[D]. 周正富.华中农业大学 2011
[8]中国油菜生产技术供需的经济学分析[D]. 李争.华中农业大学 2011
[9]油菜S45AB隐性核不育分子机理与应用研究[D]. 曾芳琴.华中农业大学 2010
[10]甘蓝型油菜隐性核不育恢复基因BnMS2的精细定位与候选基因鉴定[D]. 雷绍林.华中农业大学 2009
硕士论文
[1]甘蓝型油菜7365恢复基因BnaMs3作用机理研究[D]. 郭翔.华中农业大学 2018
[2]不同作物Tic40对新型嵌合基因Bnams4b功能的影响[D]. 田甜甜.华中农业大学 2017
[3]热激打破Bnams4b引起的拟南芥雄性不育及其转录组分析[D]. 樊煜.华中农业大学 2017
[4]甘蓝型油菜隐性细胞核不育恢复基因BnMs4的精细定位及候选区段确定[D]. 程玲.华中农业大学 2012
[5]甘蓝型油菜隐性上位核不育的分子机理研究[D]. 朱云.华中农业大学 2008
本文编号：3262348
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