甘蓝型油菜DREPP基因克隆与功能初步分析

发布时间：2021-07-10 19:45

　　DREPP（developmentally regulated plasma membrane polypetides,Pfam:PF05558）蛋白在植物中广泛存在,研究表明DREPP家族蛋白参与了植物对生物和非生物胁迫的响应与调控。本研究从甘蓝型油菜品种"中双11号"中通过分子克隆手段成功克隆获得2个编码甘蓝型油菜BnDREPP蛋白基因的全长CDS序列,构建植物过表达载体并转化拟南芥,利用实时荧光定量PCR研究甘蓝型油菜BnDREPPs基因的组织表达特性及其对外界非生物胁迫响应特点。主要工作内容及结果如下:1、甘蓝型油菜BnDREPPs基因生物信息学分析本研究利用同源克隆的方法,将拟南芥DREPP家族蛋白成员MDP25蛋白序列在甘蓝型油菜基因组数据库中进行比对,得到4个与MDP25同源的候选基因,分别命名为BnDREPP1/BnDREPP2、BnDREPP3、BnDREPP4。其中 BnDREPP1、BnDREPP2 和 BnDREPP3分别与甘蓝型油菜数据库中的BnaA0lg35060D、BnaC07g36310D和BnaA03g44480D相对应,而BnDREPP4在油菜染色体... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语
1 文献综述
    1.1 研究背景
        1.1.1 植物的非生物胁迫
        1.1.2 植物DREPP蛋白的发现
        1.1.3 植物DREPP蛋白功能研究进展
    1.2 研究目的及意义
        1.2.1 研究目的及意义
        1.2.2 主要研究内容
        1.2.3 研究技术路线
2 甘蓝型油菜BnDREPPs基因的生物信息学分析
    2.1 实验方法与步骤
        2.1.1 甘蓝型油菜BnDREPPs基因的同源检索
        2.1.2 目的基因生物信息学分析
    2.2 实验结果与分析
        2.2.1 甘蓝型油菜BnDREPPs基因序列分析
        2.2.2 甘蓝型油菜BnDREPP蛋白一级结构预测分析
        2.2.3 甘蓝型油菜BnDREPP蛋白二级结构预测分析
        2.2.4 甘蓝型油菜BnDR EPP蛋白三级结构预测分析
        2.2.5 甘蓝型油菜BnDREPP蛋白信号肽及跨膜区预测
        2.2.6 甘蓝型油菜BnDREPP蛋白的功能结构域和亚细胞定位预测
        2.2.7 甘蓝型油菜BnDREPP蛋白功能预测
        2.2.8 甘蓝型油菜BnDREPP蛋白多序列比对和进化分析
    2.3 讨论和小结
3 甘蓝型油菜BnDREPPs基因超表达载体的构建及拟南芥转化
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料和菌株
        3.1.2 主要实验试剂
        3.1.3 主要仪器设备
        3.1.4 主要培养基和溶液的配制
    3.2 目的基因克隆
        3.2.1 引物设计
        3.2.2 甘蓝型油菜总RNA的提取
        3.2.3 单链cDNA的合成
        3.2.4 BnDREPPs全长CDS序列的扩增
    3.3 目的基因超表达载体的构建
        3.3.1 载体质粒提取
        3.3.2 目的基因的连接及转化
        3.3.3 重组质粒的PCR鉴定与测序
    3.4 pCXSN::BnDREPP2转化拟南芥
        3.4.1 农杆菌GV30101感受态细胞的制备
        3.4.2 冻融法转化农杆菌
        3.4.3 浸花法转化拟南芥
        3.4.4 拟南芥幼苗微量DNA的提取
        3.4.5 转基因拟南芥植株的分子检测
    3.5 结果与分析
        3.5.1 甘蓝型油菜总RNA的提取检测
        3.5.2 甘蓝型油菜BnDREPPs基因的克隆
        3.5.3 目的基因超表达载体的构建与鉴定
        3.5.4 重组质粒转化农杆菌阳性转化子的筛选
        3.5.5 转基因拟南芥T_0代的筛选
        3.5.6 转基因拟南芥T_0代的检测及表型观察
        3.5.7 T_1转基因代拟南芥的检测及表型观察
    3.6 讨论和小结
        3.6.1 甘蓝型油菜BnDREPPs基因的克隆与载体构建
        3.6.2 农杆菌介导法转化拟南芥
        3.6.3 转基因拟南芥植株的检测及表型观察
4 甘蓝型油菜BnDREPPs基因组织表达分析与胁迫表达分析
    4.1 实验材料与试剂
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要仪器设备
        4.1.3 主要试剂及试剂盒
        4.1.4 主要溶液及缓冲液配方
    4.2 实验方法与步骤
        4.2.1 基因组织表达分析取材
        4.2.2 逆境胁迫处理
        4.2.3 实时荧光定量PCR检测
    4.3 结果与分析
        4.3.1 甘蓝型油菜BnDREPPs基因组织表达模式分析
        4.3.2 非生物胁迫下BnDREPPs基因表达模式分析
    4.4 讨论和小结
        4.4.1 甘蓝型油菜BnDREPPs基因组织表达分析
        4.4.2 非生物胁迫下甘蓝型油菜BnDREPPs的表达模式
5 甘蓝型油菜BnDREPP2基因启动子分析载体的构建
    5.1 实验材料和试剂
    5.2 实验方法与步骤
        5.2.1 甘蓝型油菜BnDREPP2基因启动子区的克隆
        5.2.2 甘蓝型油菜BnDREPP2基因启动子分析载体的构建
    5.3 结果与分析
        5.3.1 甘蓝型油菜BnDREPP2基因启动子区的克隆
        5.3.2 甘蓝型油菜BnDREPP2基因启动子分析载体的构建及序列分析
    5.4 讨论
6 总结与展望
    6.1 主要结论
    6.2 后续研究工作
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]油菜转基因技术研究进展[J]. 成日辉,匡代勇,杨源树,唐伟杰,邓力超.  现代农业科技. 2016(02)
[2]GA和其它植物激素的相互作用[J]. 夏慧.  生物技术世界. 2015(08)
[3]植物耐盐性的信号转导途径及相关基因研究进展[J]. 吴剑,宋宝安,胡德禹,杨松.  山地农业生物学报. 2011(05)
[4]农杆菌介导microRNA398靶基因转化大豆[J]. 孙佃臣,沙爱华,单志慧,周蓉,陈李淼,周新安.  中国油料作物学报. 2011(05)
[5]分子检测技术在转基因药用植物研究中的应用[J]. 林秀艳,陆续,沈乾,唐克轩.  上海交通大学学报(农业科学版). 2011(01)
[6]高等植物特异启动子研究现状[J]. 赖鹏程.  安徽农学通报(上半月刊). 2011(03)
[7]甘蓝型油菜高质量DNA提取方法研究[J]. 张宁洁,熊光明,朱文秀,张品,秦信荣.  农家之友(理论版). 2010(09)
[8]植物遗传转化农杆菌浸花法研究进展[J]. 高建强,梁华,赵军.  中国农学通报. 2010(16)
[9]植物抗逆基因研究进展[J]. 杨柳,张振乾,宋继金,谭太龙,官春云,刘忠松.  作物研究. 2010(02)
[10]拟南芥与生物胁迫因子相互作用研究进展[J]. 杨宁,王静.  阴山学刊(自然科学). 2010(01)

博士论文
[1]拟南芥微管去稳定蛋白MDP25调控花粉管生长机制的研究[D]. 秦涛.中国农业大学 2014
[2]拟南芥MAP18调控花粉管生长方向的机理研究[D]. 张焱.中国农业大学 2014
[3]油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究[D]. 陈良.华中师范大学 2011

硕士论文
[1]烟草ABF转录因子基因的克隆及功能分析[D]. 杨玲.重庆大学 2014



本文编号：3276547