利用CRISPR/Cas9技术编辑Pi21和D3基因改良水稻抗性和株型的研究
发布时间：2021-07-10 20:17
我国作为人口大国,确保粮食产量稳定是关系国计民生的重要问题。针对有限的土地资源,培育多抗、高产、优质的品种是确保粮食安全的根本途径。杂交育种等传统方法由于具有分子机理不清、针对性较差及选育周期较长等问题,已经逐渐难以适应日益提高的育种目标,而CRISPR/Cas9技术通过编辑植物内源基因来改良抗性、提高产量,具有高效、精准的特点。YH208（宜恢208,籼稻）具有产量高、米质好等优点,但易感稻瘟病,而携带隐性抗性的Pi21等位基因对10株稻瘟病生理小种具有抗性。DS（粳稻）具有耐寒、米质优等特点,但其株高过高、易倒伏、分蘖少,而据报道D3基因负调控分蘖和株高。为此,我们利用CRISPR/Cas9技术对YH208的Pi21和DS的D3基因进行编辑以期改良其抗性或株型;同时为进一步探究Pi21、D3的作用机制以及水稻遗传改良提供材料基础。结果如下:1、利用CRISPR/Cas9编辑Pi21基因改良YH208的抗性,前期我们筛选到一份高感穗颈瘟的恢复系YH208（宜恢208）,将其与Pi21感病等位基因进行比对分析,发现在其238-247、454-468处有1bp的置换（C替换成T）以及9b...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
YH208中Pi21与已报道的抗、感Pi21等位基因序列比对Fig.3-1SequencealignmentofthePi21alleleinYH208andthereportedresistantandsusceptiblePi21
22图3-1YH208中Pi21与已报道的抗、感Pi21等位基因序列比对Fig.3-1SequencealignmentofthePi21alleleinYH208andthereportedresistantandsusceptiblePi21alleles注：A,B.分别为宜恢208中Pi21与已报道的抗、感Pi21等位基因的CDS、氨基酸序列比对结果。3.1.2敲除Pi21基因靶位点的设计及脱靶分析我们利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统来对水稻YH208内源基因Pi21进行敲除，因前人报道与感病等位基因相比，Pi21抗病等位基因分别有21bp和48bp的缺失[103]，为此，我们通过（http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/）网站在第二外显子上这两个关键位点前设计了两个靶位点（图3-2），之后将目标序列构建到sgRNA/Cas9载体上，通过土壤农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）介导的遗传转化获得转基因水稻。此外，为了检测CRISPR/Cas9在水稻中的特异性，避免脱靶效应影响突变体表型，我们通过CRISPR/Cas9在线预测网站(http://skl.scau.edu.cn/offtarget/)工具分析了两个靶位点的潜在脱靶位点。以日本晴作为参考基因组，分析结果显示所有检测的潜在脱靶位点与两个靶位点相比都有3-5bp不相匹配，表明两个靶位点具有较好的特异性（表3-1,3-2）。图3-2Pi21的基因结构和两个靶位点的位置Fig.3-2ThegenestructureofPi21andthelocationoftwotargetsites注：内含子用直线表示，外显子用蓝色方框表示，非编码区域用白色方框表示，靶位点1、2用红色方框表示。
24型（图3-3A,B），其中KO#1和KO#2从靶位点1开始产生移码突变，而KO#2移码突变导致提前出现终止密码子，KO#4从靶位点2开始产生移码突变并产生提前终止密码子，KO#3在两个靶位点处分别缺失9、1个氨基酸序列，KO#5仅在两个靶位点之间出现移码突变（图3-3C）。ABC图3-3突变体与野生型中Pi21序列比对分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]Developing disease-resistant thermosensitive male sterile rice by multiplex gene editing[J]. Sanfeng Li,Lan Shen,Ping Hu,Qing Liu,Xudong Zhu,Qian Qian,Kejian Wang,Yuexing Wang. Journal of Integrative Plant Biology. 2019(12)
[2]基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定[J]. 杨海河,毕冬玲,张玉,邹小维,高晓庆,袁正杰,曲海艳,何海燕,瞿绍洪. 分子植物育种. 2017(11)
[3]水稻株型功能基因及其在育种上的应用[J]. 梁彦,王永红. 生命科学. 2016(10)
[4]Breeding high-yield superior quality hybrid super rice by rational design[J]. Qian Qian,Longbiao Guo,Steven M.Smith,Jiayang Li. National Science Review. 2016(03)
[5]Plant innate immunity in rice:a defense against pathogen infection[J]. Wende Liu,Guo-Liang Wang. National Science Review. 2016(03)
[6]Development of Hybrid Rice to Ensure Food Security[J]. YUAN Long-ping. Rice Science. 2014(01)
本文编号：3276594
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
YH208中Pi21与已报道的抗、感Pi21等位基因序列比对Fig.3-1SequencealignmentofthePi21alleleinYH208andthereportedresistantandsusceptiblePi21
22图3-1YH208中Pi21与已报道的抗、感Pi21等位基因序列比对Fig.3-1SequencealignmentofthePi21alleleinYH208andthereportedresistantandsusceptiblePi21alleles注：A,B.分别为宜恢208中Pi21与已报道的抗、感Pi21等位基因的CDS、氨基酸序列比对结果。3.1.2敲除Pi21基因靶位点的设计及脱靶分析我们利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统来对水稻YH208内源基因Pi21进行敲除，因前人报道与感病等位基因相比，Pi21抗病等位基因分别有21bp和48bp的缺失[103]，为此，我们通过（http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/）网站在第二外显子上这两个关键位点前设计了两个靶位点（图3-2），之后将目标序列构建到sgRNA/Cas9载体上，通过土壤农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）介导的遗传转化获得转基因水稻。此外，为了检测CRISPR/Cas9在水稻中的特异性，避免脱靶效应影响突变体表型，我们通过CRISPR/Cas9在线预测网站(http://skl.scau.edu.cn/offtarget/)工具分析了两个靶位点的潜在脱靶位点。以日本晴作为参考基因组，分析结果显示所有检测的潜在脱靶位点与两个靶位点相比都有3-5bp不相匹配，表明两个靶位点具有较好的特异性（表3-1,3-2）。图3-2Pi21的基因结构和两个靶位点的位置Fig.3-2ThegenestructureofPi21andthelocationoftwotargetsites注：内含子用直线表示，外显子用蓝色方框表示，非编码区域用白色方框表示，靶位点1、2用红色方框表示。
24型（图3-3A,B），其中KO#1和KO#2从靶位点1开始产生移码突变，而KO#2移码突变导致提前出现终止密码子，KO#4从靶位点2开始产生移码突变并产生提前终止密码子，KO#3在两个靶位点处分别缺失9、1个氨基酸序列，KO#5仅在两个靶位点之间出现移码突变（图3-3C）。ABC图3-3突变体与野生型中Pi21序列比对分析
【参考文献】：
期刊论文
[1]Developing disease-resistant thermosensitive male sterile rice by multiplex gene editing[J]. Sanfeng Li,Lan Shen,Ping Hu,Qing Liu,Xudong Zhu,Qian Qian,Kejian Wang,Yuexing Wang. Journal of Integrative Plant Biology. 2019(12)
[2]基于CRISPR/Cas9技术的水稻pi21基因编辑材料的创制及稻瘟病抗性鉴定[J]. 杨海河,毕冬玲,张玉,邹小维,高晓庆,袁正杰,曲海艳,何海燕,瞿绍洪. 分子植物育种. 2017(11)
[3]水稻株型功能基因及其在育种上的应用[J]. 梁彦,王永红. 生命科学. 2016(10)
[4]Breeding high-yield superior quality hybrid super rice by rational design[J]. Qian Qian,Longbiao Guo,Steven M.Smith,Jiayang Li. National Science Review. 2016(03)
[5]Plant innate immunity in rice:a defense against pathogen infection[J]. Wende Liu,Guo-Liang Wang. National Science Review. 2016(03)
[6]Development of Hybrid Rice to Ensure Food Security[J]. YUAN Long-ping. Rice Science. 2014(01)
本文编号：3276594
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/3276594.html
最近更新
教材专著
